西部医学
西部醫學
서부의학
MEDICAL JOURNAL OF WEST CHINA
2013年
12期
1770-1774
,共5页
邓昭敏%李莎%李明远%王欢%任来峰%郭连娣%刘聪%丁娜娜
鄧昭敏%李莎%李明遠%王歡%任來峰%郭連娣%劉聰%丁娜娜
산소민%리사%리명원%왕환%임래봉%곽련제%류총%정나나
同源重组%DNA双链断裂%Ⅰ-Sce I-HR
同源重組%DNA雙鏈斷裂%Ⅰ-Sce I-HR
동원중조%DNA쌍련단렬%Ⅰ-Sce I-HR
Homologous recombination%DSB%Ⅰ-Sce I-HR
目的 建立DNA损伤同源重组修复检测系统(Ⅰ-Sce I-HR),应用该系统制备DNA双链断裂(DSB)的人骨肉瘤细胞(U2OS)模型,探索细胞DNA损伤后的修复特性奠定基础.方法 通过分子克隆构建携带Ⅰ-Sce I归位内切酶识别序列的真核表达载体pcDNA3-HR-GFP,将该质粒转染入U2OS细胞中,经G418稳定筛选.随后分别瞬时转染入携带归位内切酶Ⅰ-Sce I的表达质粒pCBASCEI,以及体外经Ⅰ-Sce I线性化pcDNA3-HR-GFP.48小时后用免疫荧光方法检测DNA双链损伤效应分子-DH2AX,同时观察EGFP荧光信号;72小时后用Western blot检测报告蛋白EGFP的表达,评估DNA双链断裂后同源重组修复情况.结果 酶切鉴定和测序证实pcDNA3-HR-GFP真核表达载体构建成功;Ⅰ-Sce I-HR系统引入U2OS细胞中后,γ-H2AX表达明显上调,荧光显微镜和Western blot均显示EGFP表达.结论 DSB细胞同源重组修复模型构建成功,Ⅰ-Sce I-HR系统能够成功地诱导U2OS细胞株产生DSB,并出现同源重组修复,为进一步研究DNA同源重组信号传导提供了有效的研究工具.
目的 建立DNA損傷同源重組脩複檢測繫統(Ⅰ-Sce I-HR),應用該繫統製備DNA雙鏈斷裂(DSB)的人骨肉瘤細胞(U2OS)模型,探索細胞DNA損傷後的脩複特性奠定基礎.方法 通過分子剋隆構建攜帶Ⅰ-Sce I歸位內切酶識彆序列的真覈錶達載體pcDNA3-HR-GFP,將該質粒轉染入U2OS細胞中,經G418穩定篩選.隨後分彆瞬時轉染入攜帶歸位內切酶Ⅰ-Sce I的錶達質粒pCBASCEI,以及體外經Ⅰ-Sce I線性化pcDNA3-HR-GFP.48小時後用免疫熒光方法檢測DNA雙鏈損傷效應分子-DH2AX,同時觀察EGFP熒光信號;72小時後用Western blot檢測報告蛋白EGFP的錶達,評估DNA雙鏈斷裂後同源重組脩複情況.結果 酶切鑒定和測序證實pcDNA3-HR-GFP真覈錶達載體構建成功;Ⅰ-Sce I-HR繫統引入U2OS細胞中後,γ-H2AX錶達明顯上調,熒光顯微鏡和Western blot均顯示EGFP錶達.結論 DSB細胞同源重組脩複模型構建成功,Ⅰ-Sce I-HR繫統能夠成功地誘導U2OS細胞株產生DSB,併齣現同源重組脩複,為進一步研究DNA同源重組信號傳導提供瞭有效的研究工具.
목적 건립DNA손상동원중조수복검측계통(Ⅰ-Sce I-HR),응용해계통제비DNA쌍련단렬(DSB)적인골육류세포(U2OS)모형,탐색세포DNA손상후적수복특성전정기출.방법 통과분자극륭구건휴대Ⅰ-Sce I귀위내절매식별서렬적진핵표체재체pcDNA3-HR-GFP,장해질립전염입U2OS세포중,경G418은정사선.수후분별순시전염입휴대귀위내절매Ⅰ-Sce I적표체질립pCBASCEI,이급체외경Ⅰ-Sce I선성화pcDNA3-HR-GFP.48소시후용면역형광방법검측DNA쌍련손상효응분자-DH2AX,동시관찰EGFP형광신호;72소시후용Western blot검측보고단백EGFP적표체,평고DNA쌍련단렬후동원중조수복정황.결과 매절감정화측서증실pcDNA3-HR-GFP진핵표체재체구건성공;Ⅰ-Sce I-HR계통인입U2OS세포중후,γ-H2AX표체명현상조,형광현미경화Western blot균현시EGFP표체.결론 DSB세포동원중조수복모형구건성공,Ⅰ-Sce I-HR계통능구성공지유도U2OS세포주산생DSB,병출현동원중조수복,위진일보연구DNA동원중조신호전도제공료유효적연구공구.
