实验室研究与探索
實驗室研究與探索
실험실연구여탐색
LAABORATORY REESEARCH AND EXPLORATION
2013年
11期
9-14,18
,共7页
黄莹莹%马明章%孙仁杰%詹仪花%翁晓燕
黃瑩瑩%馬明章%孫仁傑%詹儀花%翁曉燕
황형형%마명장%손인걸%첨의화%옹효연
水稻%木聚糖酶基因%克隆%同源建模%原核表达
水稻%木聚糖酶基因%剋隆%同源建模%原覈錶達
수도%목취당매기인%극륭%동원건모%원핵표체
oryza sativa%xylanase gene%cloning%homology modeling%prokaryotic expression
为进一步了解植物内源木聚糖酶基因结构及其表达特性,从水稻中克隆和表达了一种内源木聚糖酶基因.通过序列比对分析确定保守区序列,以PCR扩增得到的保守区序列从众多水稻木聚糖酶预测序列中“钓取”可能的目标基因,并以此基因为模板设计引物,通过RT-PCR扩增得到一条长度为1 443 bp的基因片段osx,测序结果与水稻木聚糖酶基因预测序列NM_001061680一致性高达99％,该序列编码480个氨基酸,经预测不存在信号肽序列.构建表达载体pET28-a(+)-osx,导入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,该表达产物未检测到木聚糖酶活性.受大麦和玉米内源木聚糖酶基因表达的前体为无活性蛋白需要剪切加工的启示,进一步通过在线蛋白同源建模分析,设计引物去掉蛋白N端约120个氨基酸,C端约40个氨基酸,保留“Glyco-hydro-10”结构域,使其成功实现了原核活性表达,表达蛋白约40 kDa,木聚糖酶活性为11.53 IU/mL.
為進一步瞭解植物內源木聚糖酶基因結構及其錶達特性,從水稻中剋隆和錶達瞭一種內源木聚糖酶基因.通過序列比對分析確定保守區序列,以PCR擴增得到的保守區序列從衆多水稻木聚糖酶預測序列中“釣取”可能的目標基因,併以此基因為模闆設計引物,通過RT-PCR擴增得到一條長度為1 443 bp的基因片段osx,測序結果與水稻木聚糖酶基因預測序列NM_001061680一緻性高達99％,該序列編碼480箇氨基痠,經預測不存在信號肽序列.構建錶達載體pET28-a(+)-osx,導入大腸桿菌BL21進行IPTG誘導錶達,該錶達產物未檢測到木聚糖酶活性.受大麥和玉米內源木聚糖酶基因錶達的前體為無活性蛋白需要剪切加工的啟示,進一步通過在線蛋白同源建模分析,設計引物去掉蛋白N耑約120箇氨基痠,C耑約40箇氨基痠,保留“Glyco-hydro-10”結構域,使其成功實現瞭原覈活性錶達,錶達蛋白約40 kDa,木聚糖酶活性為11.53 IU/mL.
위진일보료해식물내원목취당매기인결구급기표체특성,종수도중극륭화표체료일충내원목취당매기인.통과서렬비대분석학정보수구서렬,이PCR확증득도적보수구서렬종음다수도목취당매예측서렬중“조취”가능적목표기인,병이차기인위모판설계인물,통과RT-PCR확증득도일조장도위1 443 bp적기인편단osx,측서결과여수도목취당매기인예측서렬NM_001061680일치성고체99％,해서렬편마480개안기산,경예측불존재신호태서렬.구건표체재체pET28-a(+)-osx,도입대장간균BL21진행IPTG유도표체,해표체산물미검측도목취당매활성.수대맥화옥미내원목취당매기인표체적전체위무활성단백수요전절가공적계시,진일보통과재선단백동원건모분석,설계인물거도단백N단약120개안기산,C단약40개안기산,보류“Glyco-hydro-10”결구역,사기성공실현료원핵활성표체,표체단백약40 kDa,목취당매활성위11.53 IU/mL.
