南京师大学报（自然科学版）
南京師大學報（自然科學版）
남경사대학보（자연과학판）
JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE EDITION)
2013年
3期
97-102
,共6页
张飞飞%王瑞青%朱宇鹏%马超%尚广东
張飛飛%王瑞青%硃宇鵬%馬超%尚廣東
장비비%왕서청%주우붕%마초%상엄동
融合表达载体%融合标签%伴侣蛋白%TEV%N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶
融閤錶達載體%融閤標籤%伴侶蛋白%TEV%N-乙酰-D-葡萄糖胺2-異構酶
융합표체재체%융합표첨%반려단백%TEV%N-을선-D-포도당알2-이구매
fusion expression vectors%fusion tag%chaperone%TEV%N-acetyl-D-glucosamine 2-epimerase
许多异源蛋白在大肠杆菌内的表达是以不可溶、无生物学活性的包涵体形式存在,这为蛋白质的功能研究带来困难.融合表达是提高蛋白可溶性的有效方案之一.为构建通用型融合表达载体,本研究将5种常见的融合标签即突变型麦芽糖结合蛋白(mMBP)、小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)、翻译起始因子(IF2-I)、氮源利用物质A(NusA)和谷胱甘肽转移酶(GST)以及3种伴侣蛋白(GroEL、DnaK和TF)分别克隆至pET30a(+),构建了系列融合表达载体.这些载体含有相同的克隆位点以及位于融合标签羧基端的烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位点.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因hRnBP克隆到mMBP融合表达载体后,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表明融合蛋白均得到了高效表达且几乎完全可溶,TEV酶切获得了预期的带型.全细胞偶联生成N-乙酰-D-神经氨酸实验发现mMBP-hRnBP的摩尔转化率较无mMBP标签的体系提高了近60％,证明了融合表达载体中融合标签的适用性.新型的原核融合表达载体为蛋白的融合表达、分离纯化及功能研究提供了更多的选择.
許多異源蛋白在大腸桿菌內的錶達是以不可溶、無生物學活性的包涵體形式存在,這為蛋白質的功能研究帶來睏難.融閤錶達是提高蛋白可溶性的有效方案之一.為構建通用型融閤錶達載體,本研究將5種常見的融閤標籤即突變型麥芽糖結閤蛋白(mMBP)、小分子汎素樣脩飾蛋白(SUMO)、翻譯起始因子(IF2-I)、氮源利用物質A(NusA)和穀胱甘肽轉移酶(GST)以及3種伴侶蛋白(GroEL、DnaK和TF)分彆剋隆至pET30a(+),構建瞭繫列融閤錶達載體.這些載體含有相同的剋隆位點以及位于融閤標籤羧基耑的煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV)的酶切位點.N-乙酰-D-葡萄糖胺2-異構酶基因hRnBP剋隆到mMBP融閤錶達載體後,經IPTG誘導,SDS-PAGE檢測錶明融閤蛋白均得到瞭高效錶達且幾乎完全可溶,TEV酶切穫得瞭預期的帶型.全細胞偶聯生成N-乙酰-D-神經氨痠實驗髮現mMBP-hRnBP的摩爾轉化率較無mMBP標籤的體繫提高瞭近60％,證明瞭融閤錶達載體中融閤標籤的適用性.新型的原覈融閤錶達載體為蛋白的融閤錶達、分離純化及功能研究提供瞭更多的選擇.
허다이원단백재대장간균내적표체시이불가용、무생물학활성적포함체형식존재,저위단백질적공능연구대래곤난.융합표체시제고단백가용성적유효방안지일.위구건통용형융합표체재체,본연구장5충상견적융합표첨즉돌변형맥아당결합단백(mMBP)、소분자범소양수식단백(SUMO)、번역기시인자(IF2-I)、담원이용물질A(NusA)화곡광감태전이매(GST)이급3충반려단백(GroEL、DnaK화TF)분별극륭지pET30a(+),구건료계렬융합표체재체.저사재체함유상동적극륭위점이급위우융합표첨최기단적연초식각병독단백매(TEV)적매절위점.N-을선-D-포도당알2-이구매기인hRnBP극륭도mMBP융합표체재체후,경IPTG유도,SDS-PAGE검측표명융합단백균득도료고효표체차궤호완전가용,TEV매절획득료예기적대형.전세포우련생성N-을선-D-신경안산실험발현mMBP-hRnBP적마이전화솔교무mMBP표첨적체계제고료근60％,증명료융합표체재체중융합표첨적괄용성.신형적원핵융합표체재체위단백적융합표체、분리순화급공능연구제공료경다적선택.
