生物技术
生物技術
생물기술
BIOTECHNOLOGY
2011年
3期
1-5
,共5页
Hsp90α%克隆%原核表达%生物信息学
Hsp90α%剋隆%原覈錶達%生物信息學
Hsp90α%극륭%원핵표체%생물신식학
目的:克隆获得人热休克蛋白90α(Hsp90α)基因,构建其原核表达载体,分离纯化重组蛋白,为Hsp90抑制剂的体外筛选奠定基础.方法:TRIzol Reagent法提取K562细胞总RNA,通过RT-PCR获得Hsp90α-cDNA.以该cDNA为模板PCR扩增Hsp90α基因,目的基因和质粒pET28a(+)经Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,连接酶切片段,将重组DNA转化DH5α,酶切及测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导,经条件优化后进行中试发酵、纯化以及Western blot鉴定.结果:原核表达载体pET28a(+)-Hsp90α成功构建,可在Rosetta(DE3)中正确表达,中试发酵收菌574g且表达产物以可溶性形式存在,纯化产物纯度为97%.结论:利用分子克隆技术建立了Hsp90α基因的原核表达和中试发酵的条件,为更深入地研究其在抗肿瘤治疗中的作用打下基础.
目的:剋隆穫得人熱休剋蛋白90α(Hsp90α)基因,構建其原覈錶達載體,分離純化重組蛋白,為Hsp90抑製劑的體外篩選奠定基礎.方法:TRIzol Reagent法提取K562細胞總RNA,通過RT-PCR穫得Hsp90α-cDNA.以該cDNA為模闆PCR擴增Hsp90α基因,目的基因和質粒pET28a(+)經Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切後,連接酶切片段,將重組DNA轉化DH5α,酶切及測序鑒定重組體.將構建好的重組質粒轉化Rosetta(DE3)菌株,IPTG誘導,經條件優化後進行中試髮酵、純化以及Western blot鑒定.結果:原覈錶達載體pET28a(+)-Hsp90α成功構建,可在Rosetta(DE3)中正確錶達,中試髮酵收菌574g且錶達產物以可溶性形式存在,純化產物純度為97%.結論:利用分子剋隆技術建立瞭Hsp90α基因的原覈錶達和中試髮酵的條件,為更深入地研究其在抗腫瘤治療中的作用打下基礎.
목적:극륭획득인열휴극단백90α(Hsp90α)기인,구건기원핵표체재체,분리순화중조단백,위Hsp90억제제적체외사선전정기출.방법:TRIzol Reagent법제취K562세포총RNA,통과RT-PCR획득Hsp90α-cDNA.이해cDNA위모판PCR확증Hsp90α기인,목적기인화질립pET28a(+)경Nco Ⅰ화Xho Ⅰ쌍매절후,련접매절편단,장중조DNA전화DH5α,매절급측서감정중조체.장구건호적중조질립전화Rosetta(DE3)균주,IPTG유도,경조건우화후진행중시발효、순화이급Western blot감정.결과:원핵표체재체pET28a(+)-Hsp90α성공구건,가재Rosetta(DE3)중정학표체,중시발효수균574g차표체산물이가용성형식존재,순화산물순도위97%.결론:이용분자극륭기술건립료Hsp90α기인적원핵표체화중시발효적조건,위경심입지연구기재항종류치료중적작용타하기출.
