生命科学研究
生命科學研究
생명과학연구
LIFE SCIENCE RESEARCH
2013年
3期
230-237
,共8页
李磊%杨远柱%刘泓%杜长青%林建中%朱咏华%刘选明
李磊%楊遠柱%劉泓%杜長青%林建中%硃詠華%劉選明
리뢰%양원주%류홍%두장청%림건중%주영화%류선명
FvGDH%Gateway克隆%原核表达%SDS-PAGE%Western blotting
FvGDH%Gateway剋隆%原覈錶達%SDS-PAGE%Western blotting
FvGDH%Gateway극륭%원핵표체%SDS-PAGE%Western blotting
FvGDH%Gateway clone%prokaryotic expression%SDS-PAGE%Western blotting
利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得Fv GDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-Fv GDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDEST17-FvGDH,转化大肠杆菌BL21 (DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4h.融合蛋白表达量较高,实现了FvG DH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.
利用簡併引物和RT-PCR方法從金針菇(Flammulina velutipes)幼嫩子實體中剋隆穫得Fv GDH全長cDNA序列.構建入門載體pGWC-Fv GDH,利用Gateway剋隆技術的LR反應構建原覈重組錶達載體pDEST17-FvGDH,轉化大腸桿菌BL21 (DE3).通過IPTG法誘導錶達融閤蛋白併進行錶達條件優化.SDS-PAGE蛋白電泳分析錶明,融閤蛋白相對分子質量約為53 kD,與預測的一緻.最佳錶達條件為溫度30℃、IPTG濃度0.4mmol/L、誘導4h.融閤蛋白錶達量較高,實現瞭FvG DH的高效錶達,併利用Western blotting對其特異性進行鑒定.FvGDH基因高效原覈錶達體繫的成功建立,為進一步研究FvGDH的酶促動力學奠定瞭基礎.
이용간병인물화RT-PCR방법종금침고(Flammulina velutipes)유눈자실체중극륭획득Fv GDH전장cDNA서렬.구건입문재체pGWC-Fv GDH,이용Gateway극륭기술적LR반응구건원핵중조표체재체pDEST17-FvGDH,전화대장간균BL21 (DE3).통과IPTG법유도표체융합단백병진행표체조건우화.SDS-PAGE단백전영분석표명,융합단백상대분자질량약위53 kD,여예측적일치.최가표체조건위온도30℃、IPTG농도0.4mmol/L、유도4h.융합단백표체량교고,실현료FvG DH적고효표체,병이용Western blotting대기특이성진행감정.FvGDH기인고효원핵표체체계적성공건립,위진일보연구FvGDH적매촉동역학전정료기출.
