中国防痨杂志
中國防癆雜誌
중국방로잡지
BULLETIN OF THE CHINESE ANTITUBERCULOSIS ASSOCIATION
2013年
9期
679-685
,共7页
段安虎%张薇%柏银兰%康健%王瑞%徐志凯%王丽梅
段安虎%張薇%柏銀蘭%康健%王瑞%徐誌凱%王麗梅
단안호%장미%백은란%강건%왕서%서지개%왕려매
分枝杆菌,结核%抗原,细菌%疫苗,DNA%抗体生成%免疫,细胞
分枝桿菌,結覈%抗原,細菌%疫苗,DNA%抗體生成%免疫,細胞
분지간균,결핵%항원,세균%역묘,DNA%항체생성%면역,세포
Mycobacterium tuberculosis%Antigens,bacterial%Vaccines,DNA%Antibody formation%Immunity,cellular
目的 构建结核分枝杆菌(Mtb)休眠相关抗原Rv1733c的真核表达载体,并评价其作为DNA疫苗的免疫学特性.方法 利用限制性酶切的方法从本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c质粒中构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.将pcDNA-Rv1733c重组质粒稳定转染P815细胞,并用间接免疫荧光法检测Rv1733c的表达.采用数字表法随机将BALB/c小鼠分为3组,每组10只,即pcDNA-Rv1733c质粒DNA组、生理盐水组和BCG组.pcDNA-Rv1733c质粒DNA组和生理盐水组采用肌内注射方式免疫,间隔2周免疫1次,共免疫3次.BCG组采用皮下免疫一次.各组小鼠每2周采血,ELISA检测血清中特异性抗体水平和IgG2a/IgG1抗体亚类比率与比值.初次免疫8周后,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-etrazolium,inner salt](四氮唑蓝盐化合物)法检测小鼠脾淋巴细胞特异性增殖、ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平.流式细胞法检测脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T细胞所占比率；LDH法检测CTL(cytotoxic T lymphocytes;细胞毒性T淋巴细胞)活性.结果 成功构建Rv1733c的真核表达载体pcDNA-Rv1733c.间接免疫荧光实验表明pcDNA-Rv1733c质粒稳定转染的P815细胞中能够稳定表达Rv1733c蛋白.pcDNA-Rv1733c质粒DNA免疫小鼠后能诱导小鼠产生特异性抗体,抗体亚类以IgG2a为主,随着免疫时间的延长,IgG2a/IgG1的比值趋于平衡；脾淋巴细胞增殖指数(2.00±0.36)高于BCG组(1.1±0.06)(t=3.096,P＜0.05)；特异性分泌IFN-γ的脾淋巴细胞频数(41.48±5.30)SFC/ 106高于生理盐水组(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P＜0.05)；然而脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞所占比率[分别为(18.15±2.30)％、(7.68±1.34)％]、CTL杀伤活性[(29.52±1.96)％]都与生理盐水组相当[(16.43±2.02)％ (t=0.571,P＞0.05)、(7.32±0.42)％(t=0.234,P＞0.05)、(25.28±2.51)％(t=0.726,P＞0.05)].结论 成功构建Rv1733c真核表达载体pcDNA-Rv1733c;并能够诱导小鼠机体产生特异性的体液和细胞免疫应答,提示用于结核病新型疫苗的研究具有一定的意义.
目的 構建結覈分枝桿菌(Mtb)休眠相關抗原Rv1733c的真覈錶達載體,併評價其作為DNA疫苗的免疫學特性.方法 利用限製性酶切的方法從本室前期保存的pMD-18T-Rv1733c質粒中構建Rv1733c的真覈錶達載體pcDNA-Rv1733c.將pcDNA-Rv1733c重組質粒穩定轉染P815細胞,併用間接免疫熒光法檢測Rv1733c的錶達.採用數字錶法隨機將BALB/c小鼠分為3組,每組10隻,即pcDNA-Rv1733c質粒DNA組、生理鹽水組和BCG組.pcDNA-Rv1733c質粒DNA組和生理鹽水組採用肌內註射方式免疫,間隔2週免疫1次,共免疫3次.BCG組採用皮下免疫一次.各組小鼠每2週採血,ELISA檢測血清中特異性抗體水平和IgG2a/IgG1抗體亞類比率與比值.初次免疫8週後,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-etrazolium,inner salt](四氮唑藍鹽化閤物)法檢測小鼠脾淋巴細胞特異性增殖、ELISPOT檢測脾淋巴細胞分泌IFN-γ的水平.流式細胞法檢測脾淋巴細胞中CD4+和CD8+T細胞所佔比率；LDH法檢測CTL(cytotoxic T lymphocytes;細胞毒性T淋巴細胞)活性.結果 成功構建Rv1733c的真覈錶達載體pcDNA-Rv1733c.間接免疫熒光實驗錶明pcDNA-Rv1733c質粒穩定轉染的P815細胞中能夠穩定錶達Rv1733c蛋白.pcDNA-Rv1733c質粒DNA免疫小鼠後能誘導小鼠產生特異性抗體,抗體亞類以IgG2a為主,隨著免疫時間的延長,IgG2a/IgG1的比值趨于平衡；脾淋巴細胞增殖指數(2.00±0.36)高于BCG組(1.1±0.06)(t=3.096,P＜0.05)；特異性分泌IFN-γ的脾淋巴細胞頻數(41.48±5.30)SFC/ 106高于生理鹽水組(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P＜0.05)；然而脾淋巴細胞中CD4+、CD8+T細胞所佔比率[分彆為(18.15±2.30)％、(7.68±1.34)％]、CTL殺傷活性[(29.52±1.96)％]都與生理鹽水組相噹[(16.43±2.02)％ (t=0.571,P＞0.05)、(7.32±0.42)％(t=0.234,P＞0.05)、(25.28±2.51)％(t=0.726,P＞0.05)].結論 成功構建Rv1733c真覈錶達載體pcDNA-Rv1733c;併能夠誘導小鼠機體產生特異性的體液和細胞免疫應答,提示用于結覈病新型疫苗的研究具有一定的意義.
목적 구건결핵분지간균(Mtb)휴면상관항원Rv1733c적진핵표체재체,병평개기작위DNA역묘적면역학특성.방법 이용한제성매절적방법종본실전기보존적pMD-18T-Rv1733c질립중구건Rv1733c적진핵표체재체pcDNA-Rv1733c.장pcDNA-Rv1733c중조질립은정전염P815세포,병용간접면역형광법검측Rv1733c적표체.채용수자표법수궤장BALB/c소서분위3조,매조10지,즉pcDNA-Rv1733c질립DNA조、생리염수조화BCG조.pcDNA-Rv1733c질립DNA조화생리염수조채용기내주사방식면역,간격2주면역1차,공면역3차.BCG조채용피하면역일차.각조소서매2주채혈,ELISA검측혈청중특이성항체수평화IgG2a/IgG1항체아류비솔여비치.초차면역8주후,MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2 H-etrazolium,inner salt](사담서람염화합물)법검측소서비림파세포특이성증식、ELISPOT검측비림파세포분비IFN-γ적수평.류식세포법검측비림파세포중CD4+화CD8+T세포소점비솔；LDH법검측CTL(cytotoxic T lymphocytes;세포독성T림파세포)활성.결과 성공구건Rv1733c적진핵표체재체pcDNA-Rv1733c.간접면역형광실험표명pcDNA-Rv1733c질립은정전염적P815세포중능구은정표체Rv1733c단백.pcDNA-Rv1733c질립DNA면역소서후능유도소서산생특이성항체,항체아류이IgG2a위주,수착면역시간적연장,IgG2a/IgG1적비치추우평형；비림파세포증식지수(2.00±0.36)고우BCG조(1.1±0.06)(t=3.096,P＜0.05)；특이성분비IFN-γ적비림파세포빈수(41.48±5.30)SFC/ 106고우생리염수조(2.75±1.37)SFC/106(t=4.752,P＜0.05)；연이비림파세포중CD4+、CD8+T세포소점비솔[분별위(18.15±2.30)％、(7.68±1.34)％]、CTL살상활성[(29.52±1.96)％]도여생리염수조상당[(16.43±2.02)％ (t=0.571,P＞0.05)、(7.32±0.42)％(t=0.234,P＞0.05)、(25.28±2.51)％(t=0.726,P＞0.05)].결론 성공구건Rv1733c진핵표체재체pcDNA-Rv1733c;병능구유도소서궤체산생특이성적체액화세포면역응답,제시용우결핵병신형역묘적연구구유일정적의의.
