CAJ | 학술논문

目的:克隆人BTB-Kelch家族蛋白KLHL32编码基因并初步鉴定其在细胞中的功能.方法:采用实时荧光定量PCR分析Toll样受体5(Toll-like receptor5,TLR5)特异性激活剂鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagllin from S.typhimurium,ST-FLA)刺激经佛波酯(phorlol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导分化的THP-1巨噬细胞中KLHL32 mRNA表达水平的变化,应用RT-PCR克隆人KLHL32编码区的cDNA序列并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1,采用萤光素酶双报告基因表达系统分析KLHL32过表达对转录因子核因子κB(NF-κB)活性的影响,并采用免疫共沉淀实验分析了KLHL32与Cul-3蛋白在细胞内的相互结合.结果:ST-FLA(100 μg/L)刺激经PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞4h引起KLHL32 mRNA的表达水平下调;成功克隆了人KLHL32基因并将其克隆至真核表达载体中获得重组质粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG,在HEK293细胞中过表达KLHL32蛋白对TNF-α诱导的转录因子NF-κB激活没有明显影响,但KLHL32可通过其氨基端的BTB结构域与Cul-3相互结合.结论:成功鉴定了人KLHL32蛋白,其通过BTB结构域与Cul-3蛋白相互结合,可能是一种潜在的E3泛素连接酶,证实了TLR5受体激活可诱导其表达水平的下调,提示KLHL32蛋白在细胞中可能参与炎症细胞信号转导的调控.
목적:극륭인BTB-Kelch가족단백KLHL32편마기인병초보감정기재세포중적공능.방법:채용실시형광정량PCR분석Toll양수체5(Toll-like receptor5,TLR5)특이성격활제서상한사문균편모단백(flagllin from S.typhimurium,ST-FLA)자격경불파지(phorlol 12-myristate 13-acetate,PMA)유도분화적THP-1거서세포중KLHL32 mRNA표체수평적변화,응용RT-PCR극륭인KLHL32편마구적cDNA서렬병장기극륭지진핵표체재체pcDNA3.1,채용형광소매쌍보고기인표체계통분석KLHL32과표체대전록인자핵인자κB(NF-κB)활성적영향,병채용면역공침정실험분석료KLHL32여Cul-3단백재세포내적상호결합.결과:ST-FLA(100 μg/L)자격경PMA유도분화적THP-1거서세포4h인기KLHL32 mRNA적표체수평하조;성공극륭료인KLHL32기인병장기극륭지진핵표체재체중획득중조질립pcDNA3.1-KLHL32-FLAG,재HEK293세포중과표체KLHL32단백대TNF-α유도적전록인자NF-κB격활몰유명현영향,단KLHL32가통과기안기단적BTB결구역여Cul-3상호결합.결론:성공감정료인KLHL32단백,기통과BTB결구역여Cul-3단백상호결합,가능시일충잠재적E3범소련접매,증실료TLR5수체격활가유도기표체수평적하조,제시KLHL32단백재세포중가능삼여염증세포신호전도적조공.