现代泌尿生殖肿瘤杂志
現代泌尿生殖腫瘤雜誌
현대비뇨생식종류잡지
JOURNAL OF CONTEMPORARY UROLOGIC AND REPRODUCTIVE ONCOLOGY
2013年
5期
298-301
,共4页
戚德峰%胡渊%曾国华%纪卫东
慼德峰%鬍淵%曾國華%紀衛東
척덕봉%호연%증국화%기위동
Ku80%逆转录病毒载体%RNA干扰%肾肿瘤
Ku80%逆轉錄病毒載體%RNA榦擾%腎腫瘤
Ku80%역전록병독재체%RNA간우%신종류
目的 构建并鉴定逆转录病毒介导的Ku80基因RNA干扰表达体系,并建立稳定、高效、长久低表达Ku80的人肾癌786-O细胞株.方法 针对Ku80基因,设计并合成3对特异性RNA干扰靶序列,退火形成双链DNA,与BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切后的pSUPERretro-puro载体连接,构建pSUPERretro-puro-siKu80干扰表达载体,并对重组载体进行测序鉴定.筛选出基因沉默效应最强的干扰序列后使用磷酸钙法共转染293FT细胞,产生的病毒颗粒随后感染786-O细胞,经嘌呤霉素筛选得到阳性克隆.用RT-PCR检测Ku80基因mRNA表达,Western blot测定转染后786-O细胞中Ku80蛋白的表达量,以鉴定稳定细胞株.结果 测序结果证实目的 片断正确插入pSUPERretro-puro表达载体中,成功构建了pSUPERretro-puro-siKu80干扰表达载体,稳定转染干扰表达载体的786-O细胞Ku80基因的表达显著降低.结论 成功构建了抑制Ku80基因表达的逆转录病毒载体,并获得Ku基因稳定干扰的人肾癌786-O细胞株,为下一步利用小干扰RNA技术研究肾癌的基因治疗奠定了基础.
目的 構建併鑒定逆轉錄病毒介導的Ku80基因RNA榦擾錶達體繫,併建立穩定、高效、長久低錶達Ku80的人腎癌786-O細胞株.方法 針對Ku80基因,設計併閤成3對特異性RNA榦擾靶序列,退火形成雙鏈DNA,與BglⅡ和Hind Ⅲ雙酶切後的pSUPERretro-puro載體連接,構建pSUPERretro-puro-siKu80榦擾錶達載體,併對重組載體進行測序鑒定.篩選齣基因沉默效應最彊的榦擾序列後使用燐痠鈣法共轉染293FT細胞,產生的病毒顆粒隨後感染786-O細胞,經嘌呤黴素篩選得到暘性剋隆.用RT-PCR檢測Ku80基因mRNA錶達,Western blot測定轉染後786-O細胞中Ku80蛋白的錶達量,以鑒定穩定細胞株.結果 測序結果證實目的 片斷正確插入pSUPERretro-puro錶達載體中,成功構建瞭pSUPERretro-puro-siKu80榦擾錶達載體,穩定轉染榦擾錶達載體的786-O細胞Ku80基因的錶達顯著降低.結論 成功構建瞭抑製Ku80基因錶達的逆轉錄病毒載體,併穫得Ku基因穩定榦擾的人腎癌786-O細胞株,為下一步利用小榦擾RNA技術研究腎癌的基因治療奠定瞭基礎.
목적 구건병감정역전록병독개도적Ku80기인RNA간우표체체계,병건립은정、고효、장구저표체Ku80적인신암786-O세포주.방법 침대Ku80기인,설계병합성3대특이성RNA간우파서렬,퇴화형성쌍련DNA,여BglⅡ화Hind Ⅲ쌍매절후적pSUPERretro-puro재체련접,구건pSUPERretro-puro-siKu80간우표체재체,병대중조재체진행측서감정.사선출기인침묵효응최강적간우서렬후사용린산개법공전염293FT세포,산생적병독과립수후감염786-O세포,경표령매소사선득도양성극륭.용RT-PCR검측Ku80기인mRNA표체,Western blot측정전염후786-O세포중Ku80단백적표체량,이감정은정세포주.결과 측서결과증실목적 편단정학삽입pSUPERretro-puro표체재체중,성공구건료pSUPERretro-puro-siKu80간우표체재체,은정전염간우표체재체적786-O세포Ku80기인적표체현저강저.결론 성공구건료억제Ku80기인표체적역전록병독재체,병획득Ku기인은정간우적인신암786-O세포주,위하일보이용소간우RNA기술연구신암적기인치료전정료기출.
