中国药理学与毒理学杂志
中國藥理學與毒理學雜誌
중국약이학여독이학잡지
CHINESE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY
2013年
1期
29-33
,共5页
慢病毒%ErbB4%海马%齿状回
慢病毒%ErbB4%海馬%齒狀迴
만병독%ErbB4%해마%치상회
目的 构建靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体,包装产生高滴度慢病毒并观察其感染小鼠海马齿状回基因的表达.方法 将靶向ErbB4基因的miRNA干扰质粒利用Gateway重组技术构建慢病毒表达质粒,并与慢病毒包装系统共转染HEK293T包装细胞,收获上清并浓缩得到慢病毒浓缩液,通过测定绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定其滴度.所得慢病毒浓缩液经立体定位微量注射感染小鼠海马齿状回.观察鼠脑冰冻切片基因表达情况,并用神经元标志物神经元核抗原(NeuN)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性抗体行免疫染色分析转导的细胞类型.结果 阳性克隆测序结果与设计序列一致,说明靶向ErbB4基因的miRNA慢病毒干扰载体构建成功.包装收获慢病毒.浓缩的慢病毒包装上清感染HEK293T细胞后,流式细胞术检测GFP阳性率,计算得慢病毒活性滴度为1.0×1012转导单位(TU)·L-1.小鼠海马齿状回立体定位微量注射1.0×1012 TU· L-1慢病毒6个月后,观察到注射部位外源基因的显著表达.免疫荧光染色显示,慢病毒转导的细胞多呈NeuN标记阳性,并与GFAP的表达不重叠.结论 靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体构建成功,获得了靶向ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒颗粒,并实现了脑实质的局部长期稳定转导,慢病毒转导的主要细胞类型为神经元.
目的 構建靶嚮ErbB4的miRNA慢病毒載體,包裝產生高滴度慢病毒併觀察其感染小鼠海馬齒狀迴基因的錶達.方法 將靶嚮ErbB4基因的miRNA榦擾質粒利用Gateway重組技術構建慢病毒錶達質粒,併與慢病毒包裝繫統共轉染HEK293T包裝細胞,收穫上清併濃縮得到慢病毒濃縮液,通過測定綠色熒光蛋白(GFP)錶達水平測定其滴度.所得慢病毒濃縮液經立體定位微量註射感染小鼠海馬齒狀迴.觀察鼠腦冰凍切片基因錶達情況,併用神經元標誌物神經元覈抗原(NeuN)和星形膠質細胞標誌物膠質纖維痠性蛋白(GFAP)特異性抗體行免疫染色分析轉導的細胞類型.結果 暘性剋隆測序結果與設計序列一緻,說明靶嚮ErbB4基因的miRNA慢病毒榦擾載體構建成功.包裝收穫慢病毒.濃縮的慢病毒包裝上清感染HEK293T細胞後,流式細胞術檢測GFP暘性率,計算得慢病毒活性滴度為1.0×1012轉導單位(TU)·L-1.小鼠海馬齒狀迴立體定位微量註射1.0×1012 TU· L-1慢病毒6箇月後,觀察到註射部位外源基因的顯著錶達.免疫熒光染色顯示,慢病毒轉導的細胞多呈NeuN標記暘性,併與GFAP的錶達不重疊.結論 靶嚮ErbB4的miRNA慢病毒載體構建成功,穫得瞭靶嚮ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒顆粒,併實現瞭腦實質的跼部長期穩定轉導,慢病毒轉導的主要細胞類型為神經元.
목적 구건파향ErbB4적miRNA만병독재체,포장산생고적도만병독병관찰기감염소서해마치상회기인적표체.방법 장파향ErbB4기인적miRNA간우질립이용Gateway중조기술구건만병독표체질립,병여만병독포장계통공전염HEK293T포장세포,수획상청병농축득도만병독농축액,통과측정록색형광단백(GFP)표체수평측정기적도.소득만병독농축액경입체정위미량주사감염소서해마치상회.관찰서뇌빙동절편기인표체정황,병용신경원표지물신경원핵항원(NeuN)화성형효질세포표지물효질섬유산성단백(GFAP)특이성항체행면역염색분석전도적세포류형.결과 양성극륭측서결과여설계서렬일치,설명파향ErbB4기인적miRNA만병독간우재체구건성공.포장수획만병독.농축적만병독포장상청감염HEK293T세포후,류식세포술검측GFP양성솔,계산득만병독활성적도위1.0×1012전도단위(TU)·L-1.소서해마치상회입체정위미량주사1.0×1012 TU· L-1만병독6개월후,관찰도주사부위외원기인적현저표체.면역형광염색현시,만병독전도적세포다정NeuN표기양성,병여GFAP적표체불중첩.결론 파향ErbB4적miRNA만병독재체구건성공,획득료파향ErbB4기인적고적도miRNA만병독과립,병실현료뇌실질적국부장기은정전도,만병독전도적주요세포류형위신경원.
