CAJ | 학술논문

目的构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子.方法在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3'UTR端引入Pac Ⅰ酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep.同时,将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和海肾荧光素酶(R.luc)报告基因分别插入上述复制子质粒中,获得含有报告基因的复制子pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.hc.将上述克隆线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK-21细胞,观察不同时间点绿色荧光蛋白(GFP)的活性和R.luc活性.结果与结论获得了WNV复制子pSP6-WNrep、pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/R.luc,酶切和测序鉴定结果显示,序列与预期一致.将含有报告基因的复制子转染细胞72 h后仍能观察到荧光信号,R.luc的活性随时间延长而增强.本研究成功构建了WNV Chin-01株的RNA复制子,该复制子能够在哺乳动物细胞中有效复制并表达外源蛋白,为下一步构建WNV单轮感染病毒样颗粒奠定了基础.
목적 구건구유복제화표체활성적RNA형식적서니라병독(WNV)복제자.방법 재DNA형식적WNV복제자pWNrep적기출상,장기CMV계동자체환성SP6계동자,병재3'UTR단인입Pac Ⅰ매절위점,구건복제자극륭pSP6-WNrep.동시,장증강형록색형광단백(eGFP)화해신형광소매(R.luc)보고기인분별삽입상술복제자질립중,획득함유보고기인적복제자pSP6-WNrep/eGFP화pSP6-WNrep/R.hc.장상술극륭선성화후진행체외전록,장전록체RNA전염BHK-21세포,관찰불동시간점록색형광단백(GFP)적활성화R.luc활성.결과여결론 획득료WNV복제자pSP6-WNrep、pSP6-WNrep/eGFP화pSP6-WNrep/R.luc,매절화측서감정결과현시,서렬여예기일치.장함유보고기인적복제자전염세포72 h후잉능관찰도형광신호,R.luc적활성수시간연장이증강.본연구성공구건료WNV Chin-01주적RNA복제자,해복제자능구재포유동물세포중유효복제병표체외원단백,위하일보구건WNV단륜감염병독양과립전정료기출.