食品科学
食品科學
식품과학
FOOD SCIENCE
2013年
9期
127-134
,共8页
吴敬君%李晔%张翀%李梅%邢新会
吳敬君%李曄%張翀%李梅%邢新會
오경군%리엽%장충%리매%형신회
亲和纯化%硫酸软骨素酶AC%酶学性质%表达量优化%麦芽糖结合蛋白%重组表达
親和純化%硫痠軟骨素酶AC%酶學性質%錶達量優化%麥芽糖結閤蛋白%重組錶達
친화순화%류산연골소매AC%매학성질%표체량우화%맥아당결합단백%중조표체
为实现硫酸软骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大肠杆菌中高效表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)中扩增得到ChonAC基因cslA,采用融合蛋白技术构建麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与ChonAC的融合表达载体(MBP-ChonAC),并在低温(15℃)条件下实现MBP-ChonAC的可溶活性表达,通过MBPTrapHP可实现一步纯化,使纯度可达95％以上,酶比活力可达94.1IU/mg融合蛋白(即相当于143.8IU/mgChonAC蛋白当量).对MBP-ChonAC的酶学研究发现,其最佳催化pH值为7.5～8.0,最佳Ca2+浓度为20mmol/L,最适NaCl浓度为50mmol/L,最佳作用温度为20～35℃.MBP-ChonAC具有较好的热稳定性,在30℃时其半衰期可达8.3h.同时对其以硫酸软骨素A为底物的动力学常数测定发现,MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常数kcat稍有降低,但是差别不大,表明MBP的融合没有对ChonAC的催化能力造成影响.通过宿主优化、诱导浓度优化及培养基优化进一步提高了MBP-ChonAC的表达量,其摇瓶培养酶活力就可达10800.5IU/L.
為實現硫痠軟骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大腸桿菌中高效錶達,通過PCR方法從肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)中擴增得到ChonAC基因cslA,採用融閤蛋白技術構建麥芽糖結閤蛋白(maltose-binding protein,MBP)與ChonAC的融閤錶達載體(MBP-ChonAC),併在低溫(15℃)條件下實現MBP-ChonAC的可溶活性錶達,通過MBPTrapHP可實現一步純化,使純度可達95％以上,酶比活力可達94.1IU/mg融閤蛋白(即相噹于143.8IU/mgChonAC蛋白噹量).對MBP-ChonAC的酶學研究髮現,其最佳催化pH值為7.5～8.0,最佳Ca2+濃度為20mmol/L,最適NaCl濃度為50mmol/L,最佳作用溫度為20～35℃.MBP-ChonAC具有較好的熱穩定性,在30℃時其半衰期可達8.3h.同時對其以硫痠軟骨素A為底物的動力學常數測定髮現,MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常數kcat稍有降低,但是差彆不大,錶明MBP的融閤沒有對ChonAC的催化能力造成影響.通過宿主優化、誘導濃度優化及培養基優化進一步提高瞭MBP-ChonAC的錶達量,其搖瓶培養酶活力就可達10800.5IU/L.
위실현류산연골소매AC(chondroitinase AC,ChonAC)재대장간균중고효표체,통과PCR방법종간소황간균(Pedobacter heparinus)중확증득도ChonAC기인cslA,채용융합단백기술구건맥아당결합단백(maltose-binding protein,MBP)여ChonAC적융합표체재체(MBP-ChonAC),병재저온(15℃)조건하실현MBP-ChonAC적가용활성표체,통과MBPTrapHP가실현일보순화,사순도가체95％이상,매비활력가체94.1IU/mg융합단백(즉상당우143.8IU/mgChonAC단백당량).대MBP-ChonAC적매학연구발현,기최가최화pH치위7.5～8.0,최가Ca2+농도위20mmol/L,최괄NaCl농도위50mmol/L,최가작용온도위20～35℃.MBP-ChonAC구유교호적열은정성,재30℃시기반쇠기가체8.3h.동시대기이류산연골소A위저물적동역학상수측정발현,MBP-ChonAC상비ChonAC기Km초유증대이최화상수kcat초유강저,단시차별불대,표명MBP적융합몰유대ChonAC적최화능력조성영향.통과숙주우화、유도농도우화급배양기우화진일보제고료MBP-ChonAC적표체량,기요병배양매활력취가체10800.5IU/L.
