河南农业大学学报
河南農業大學學報
하남농업대학학보
ACTA AGRICULTURAE UNIVERSITATIS HENANENSIS
2012年
5期
535-541
,共7页
泡桐%MSAP%反应体系%引物筛选
泡桐%MSAP%反應體繫%引物篩選
포동%MSAP%반응체계%인물사선
以豫杂一号泡桐组培苗为材料,通过对影响MSAP反应体系各主要因素的优化,建立了适于泡桐MSAP分析的反应体系.结果表明,最佳酶切体系(25 μL)包含300 ng模板DNA,16 U的EcoR Ⅰ和10 U的Hap Ⅱ(MspⅠ),各双酶切8h后,80℃失活20 min；最佳连接体系(25 μL)是酶切产物20 μL,0.16 μmol·L-1 EcoR Ⅰ接头,1.6 μmol· L-1 HapⅡ(MspⅠ)接头,2.5 μL 10×T4 Buffer,2UT4连接酶,22℃连接18 h；最佳预扩反应体系(20 μL)是5μL稀释10倍的连接产物,100μmol·L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR Ⅰ和HapⅡ(MspⅠ)预扩引物各0.25 μmol·L-1,2.5 μL 10×PCR Buffer.最佳选择性扩增反应体系(20μL)为5 μL稀释30倍预扩增产物,100 μmol·L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR Ⅰ和HapⅡ(MspⅠ)选扩引物各0.3 μmol·L-1,2.5μL 10×PCR Buffer.最后,利用优化的体系,筛选出了96对适宜于泡桐MSAP分析的引物.
以豫雜一號泡桐組培苗為材料,通過對影響MSAP反應體繫各主要因素的優化,建立瞭適于泡桐MSAP分析的反應體繫.結果錶明,最佳酶切體繫(25 μL)包含300 ng模闆DNA,16 U的EcoR Ⅰ和10 U的Hap Ⅱ(MspⅠ),各雙酶切8h後,80℃失活20 min；最佳連接體繫(25 μL)是酶切產物20 μL,0.16 μmol·L-1 EcoR Ⅰ接頭,1.6 μmol· L-1 HapⅡ(MspⅠ)接頭,2.5 μL 10×T4 Buffer,2UT4連接酶,22℃連接18 h；最佳預擴反應體繫(20 μL)是5μL稀釋10倍的連接產物,100μmol·L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR Ⅰ和HapⅡ(MspⅠ)預擴引物各0.25 μmol·L-1,2.5 μL 10×PCR Buffer.最佳選擇性擴增反應體繫(20μL)為5 μL稀釋30倍預擴增產物,100 μmol·L-1 dNTP,0.5 U Taq酶,EcoR Ⅰ和HapⅡ(MspⅠ)選擴引物各0.3 μmol·L-1,2.5μL 10×PCR Buffer.最後,利用優化的體繫,篩選齣瞭96對適宜于泡桐MSAP分析的引物.
이예잡일호포동조배묘위재료,통과대영향MSAP반응체계각주요인소적우화,건립료괄우포동MSAP분석적반응체계.결과표명,최가매절체계(25 μL)포함300 ng모판DNA,16 U적EcoR Ⅰ화10 U적Hap Ⅱ(MspⅠ),각쌍매절8h후,80℃실활20 min；최가련접체계(25 μL)시매절산물20 μL,0.16 μmol·L-1 EcoR Ⅰ접두,1.6 μmol· L-1 HapⅡ(MspⅠ)접두,2.5 μL 10×T4 Buffer,2UT4련접매,22℃련접18 h；최가예확반응체계(20 μL)시5μL희석10배적련접산물,100μmol·L-1 dNTP,0.5 U Taq매,EcoR Ⅰ화HapⅡ(MspⅠ)예확인물각0.25 μmol·L-1,2.5 μL 10×PCR Buffer.최가선택성확증반응체계(20μL)위5 μL희석30배예확증산물,100 μmol·L-1 dNTP,0.5 U Taq매,EcoR Ⅰ화HapⅡ(MspⅠ)선확인물각0.3 μmol·L-1,2.5μL 10×PCR Buffer.최후,이용우화적체계,사선출료96대괄의우포동MSAP분석적인물.
