军事医学
軍事醫學
군사의학
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2013年
8期
591-597
,共7页
戴素琴%周围%邢玉华%刘体颜%谭俊杰%曲国龙%王微%刘刚%陈惠鹏
戴素琴%週圍%邢玉華%劉體顏%譚俊傑%麯國龍%王微%劉剛%陳惠鵬
대소금%주위%형옥화%류체안%담준걸%곡국룡%왕미%류강%진혜붕
大肠杆菌%链霉菌属%接合转移%整合%Red同源重组%BAC载体
大腸桿菌%鏈黴菌屬%接閤轉移%整閤%Red同源重組%BAC載體
대장간균%련매균속%접합전이%정합%Red동원중조%BAC재체
Escherichia coli%Streptomyces%conjugal transfer%integration%Red homologous recombination%BAC vector
目的 构建可由大肠杆菌接合转移至链霉菌并整合至其基因组的穿梭型BAC载体,以实现大片段基因簇在大肠杆菌中完成遗传操作后,转移至链霉菌中进行异源表达.方法 从原始B载体pBeloBAC11出发,利用pKD46介导的Red同源重组技术,将一段包含接合转移元件oriT、定点整合元件attp-int和安普霉素抗性基因Am的DNA片段替换其上的氯霉素抗性基因,该DNA片段通过PCR扩增得到,两端为待替换氯霉素抗性基因上下游55 bp的同源臂,替换后的载体通过酶切连入链霉菌组成型启动子ermEP1P2和绿色荧光蛋白(GFP)基因以验证其接合和整合功能.结果 原载体pBeloBACll的氯霉素抗性基因被成功替换,得到载体pBTIBAC1,利用该载体可在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24和1326中表达GFP,在pBTIBAC1上插入新的多克隆位点(MCS)后得到载体pBTIBAC11.结论 pBTIB AC11载体可通过接合转移携带外源基因片段进入链霉菌并整合至其基因组中,同时保留了原有BAC载体的功能元件,为大片段在链霉菌中的并源表达奠定了基础.
目的 構建可由大腸桿菌接閤轉移至鏈黴菌併整閤至其基因組的穿梭型BAC載體,以實現大片段基因簇在大腸桿菌中完成遺傳操作後,轉移至鏈黴菌中進行異源錶達.方法 從原始B載體pBeloBAC11齣髮,利用pKD46介導的Red同源重組技術,將一段包含接閤轉移元件oriT、定點整閤元件attp-int和安普黴素抗性基因Am的DNA片段替換其上的氯黴素抗性基因,該DNA片段通過PCR擴增得到,兩耑為待替換氯黴素抗性基因上下遊55 bp的同源臂,替換後的載體通過酶切連入鏈黴菌組成型啟動子ermEP1P2和綠色熒光蛋白(GFP)基因以驗證其接閤和整閤功能.結果 原載體pBeloBACll的氯黴素抗性基因被成功替換,得到載體pBTIBAC1,利用該載體可在變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans)TK24和1326中錶達GFP,在pBTIBAC1上插入新的多剋隆位點(MCS)後得到載體pBTIBAC11.結論 pBTIB AC11載體可通過接閤轉移攜帶外源基因片段進入鏈黴菌併整閤至其基因組中,同時保留瞭原有BAC載體的功能元件,為大片段在鏈黴菌中的併源錶達奠定瞭基礎.
목적 구건가유대장간균접합전이지련매균병정합지기기인조적천사형BAC재체,이실현대편단기인족재대장간균중완성유전조작후,전이지련매균중진행이원표체.방법 종원시B재체pBeloBAC11출발,이용pKD46개도적Red동원중조기술,장일단포함접합전이원건oriT、정점정합원건attp-int화안보매소항성기인Am적DNA편단체환기상적록매소항성기인,해DNA편단통과PCR확증득도,량단위대체환록매소항성기인상하유55 bp적동원비,체환후적재체통과매절련입련매균조성형계동자ermEP1P2화록색형광단백(GFP)기인이험증기접합화정합공능.결과 원재체pBeloBACll적록매소항성기인피성공체환,득도재체pBTIBAC1,이용해재체가재변연청련매균(Streptomyces lividans)TK24화1326중표체GFP,재pBTIBAC1상삽입신적다극륭위점(MCS)후득도재체pBTIBAC11.결론 pBTIB AC11재체가통과접합전이휴대외원기인편단진입련매균병정합지기기인조중,동시보류료원유BAC재체적공능원건,위대편단재련매균중적병원표체전정료기출.
