CAJ | 학술논문

目的:构建AMP活化的蛋白激酶α2亚基(AMPKα2)基因shRNA重组表达质粒,转染H9c2心肌细胞,探讨其在氯离子(Cl-)介导的心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤中的作用.方法:构建靶向AMPKα2基因的shRNA重组质粒pSuper-AMPKα2 shRNA,转染H9c2细胞;Western blotting法测定AMPKα2的蛋白表达情况.实验分5组,每组重复6次:(1)Control组;(2)A/R组;(3)Cl--free A/R组;(4)pSuper+Cl--free A/R组;(5)pSuper-AMPKα2 shRNA+ Cl--free A/R组.处理结束后,生化自动分析仪测定LDH活性,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧(ROS)水平,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性.结果:重组表达质粒pSuper-AMPKα2 shRNA经测序证明构建正确;转染心肌细胞后,AMPKα2蛋白表达明显下降;Cl--free A/R组较之A/R组细胞存活率升高,LDH含量下降,细胞凋亡减少,ROS生成减少,SOD和GSH-Px活性增加;转染pSuper-AMPKα2 shRNA质粒后,阻断了Cl--free液的保护作用,且ROS生成增加,SOD和GSH-Px活性也下降.结论:成功构建pSuper-AMPKα2 shRNA重组质粒.AMPKα2基因沉默阻断了Cl--free液对心肌细胞A/R损伤的保护作用.
목적:구건AMP활화적단백격매α2아기(AMPKα2)기인shRNA중조표체질립,전염H9c2심기세포,탐토기재록리자(Cl-)개도적심기세포결양/복양(A/R)손상중적작용.방법:구건파향AMPKα2기인적shRNA중조질립pSuper-AMPKα2 shRNA,전염H9c2세포;Western blotting법측정AMPKα2적단백표체정황.실험분5조,매조중복6차:(1)Control조;(2)A/R조;(3)Cl--free A/R조;(4)pSuper+Cl--free A/R조;(5)pSuper-AMPKα2 shRNA+ Cl--free A/R조.처리결속후,생화자동분석의측정LDH활성,MTT법측정세포존활솔,류식세포술검측세포조망화활성양(ROS)수평,시제합검측세포내초양화물기화매(SOD)화곡광감태과양화물매(GSH-Px)활성.결과:중조표체질립pSuper-AMPKα2 shRNA경측서증명구건정학;전염심기세포후,AMPKα2단백표체명현하강;Cl--free A/R조교지A/R조세포존활솔승고,LDH함량하강,세포조망감소,ROS생성감소,SOD화GSH-Px활성증가;전염pSuper-AMPKα2 shRNA질립후,조단료Cl--free액적보호작용,차ROS생성증가,SOD화GSH-Px활성야하강.결론:성공구건pSuper-AMPKα2 shRNA중조질립.AMPKα2기인침묵조단료Cl--free액대심기세포A/R손상적보호작용.