CAJ | 학술논문

目的为了更好地利用流式细胞仪筛选出有效的RNA干扰片段,构建了一系列真核表达载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H.方法将NUDC-RFP融合基因克隆至pDs载体中,构建出pDs-NUDC-RFP.载体；将人U6启动子克隆至pDs-NUDC-RFP.载体中；将shNUDC-A、B、C、D、E、F、H各个片段分别克隆至含有U6启动子的载体中,形成一系列RNA干扰载体pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H；将提取高质量的质粒通过脂质体方法转染293T细胞.用流式细胞仪分析转染的293T细胞的荧光强度和荧光细胞数量,用实时荧光相对定量RT-PCR(real-time PCR)检测NUDC-RFP mRNA的转录情况,用Western Blot法检测NUDC-RFP融合蛋白的表达水平.结果流式细胞仪检测结果显示:空白对照组的293T细胞无发光细胞；阴性对照组的293T细胞能正常发光,且发光细胞数量较多；实验组的293T细胞发光细胞数量少,荧光强度低,说明其能有效干扰NUDC RFP融合基因的表达,pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-F干扰下调效果约90％左右；pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A可干扰hNUDC RFP融合基因的表达,下调效果约85％左右；其他干扰片段pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-B、C、D、E、H下调效果在62％～75％；阴性对照组对融合基因无干扰效果；流式细胞仪检测结果与real-time PCR检测结果一致,也与Western Blot法的鉴定结果基本符合,并确定了shNUDC-F为RNA干扰效果最佳的干扰片段.结论流式细胞仪分析方法是一种有效的带荧光标记的RNA干扰载体的筛选方法,为后期研究打下了基础.
목적 위료경호지이용류식세포의사선출유효적RNA간우편단,구건료일계렬진핵표체재체pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H.방법 장NUDC-RFP융합기인극륭지pDs재체중,구건출pDs-NUDC-RFP.재체；장인U6계동자극륭지pDs-NUDC-RFP.재체중；장shNUDC-A、B、C、D、E、F、H각개편단분별극륭지함유U6계동자적재체중,형성일계렬RNA간우재체pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A、B、C、D、E、F、H；장제취고질량적질립통과지질체방법전염293T세포.용류식세포의분석전염적293T세포적형광강도화형광세포수량,용실시형광상대정량RT-PCR(real-time PCR)검측NUDC-RFP mRNA적전록정황,용Western Blot법검측NUDC-RFP융합단백적표체수평.결과 류식세포의검측결과현시:공백대조조적293T세포무발광세포；음성대조조적293T세포능정상발광,차발광세포수량교다；실험조적293T세포발광세포수량소,형광강도저,설명기능유효간우NUDC RFP융합기인적표체,pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-F간우하조효과약90％좌우；pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-A가간우hNUDC RFP융합기인적표체,하조효과약85％좌우；기타간우편단pDs-NUDC-RFP-TK-U6-shNUDC-B、C、D、E、H하조효과재62％～75％；음성대조조대융합기인무간우효과；류식세포의검측결과여real-time PCR검측결과일치,야여Western Blot법적감정결과기본부합,병학정료shNUDC-F위RNA간우효과최가적간우편단.결론 류식세포의분석방법시일충유효적대형광표기적RNA간우재체적사선방법,위후기연구타하료기출.