中国药理学通报
中國藥理學通報
중국약이학통보
CHINESE PHARMACOLOGICAL BULLETIN
2013年
8期
1098-1103
,共6页
马佳佳%Nick Lu%陈必良
馬佳佳%Nick Lu%陳必良
마가가%Nick Lu%진필량
人可溶性TNF受体1%免疫球蛋白G%哮喘%妊娠%腺病毒%真核表达
人可溶性TNF受體1%免疫毬蛋白G%哮喘%妊娠%腺病毒%真覈錶達
인가용성TNF수체1%면역구단백G%효천%임신%선병독%진핵표체
目的 构建携带人sTNFR1与IgGFc片段融合基因的重组腺病毒,稳定表达并初步鉴定其功能活性在妊娠哮喘炎症机制中的作用.方法 将PCR扩增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上,酶切线性化后在BJ5183细菌内与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,产生获得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂质体法转染AD293细胞进行病毒包装,以绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度及感染效率.RT-PCR、Western blot实验鉴定细胞内重组腺病毒转录及融合基因与蛋白表达;流式细胞术、ELISA实验分析混合培养上清中转染肥大细胞(MC)激活、调节同基因来源T细胞表达Th2/Treg水平及细胞因子分泌效果;MTT评估转染细胞上清中sTNFR1-Ig对TNF-α介导细胞毒效应的拮抗作用.结果 成功构建编码sTNFR1-Ig基因的重组腺病毒载体经酶切和测序鉴定正确,制备的腺病毒在转染细胞中的GFP表达以及CPE效应明显,扩增后的滴度为3.7×1010～4.8×1010 pfu/ml,体外感染效率可达90%以上;sTNFR1-Ig基因在 mRNA 及蛋白水平获得的清晰条带均证实腺病毒包装与扩增成功.表达sTNFR1-Ig的MC诱导T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平以及IL-12含量均明显升高,CD4+IL-4+Th2细胞水平下调(P＜0.05),Th2/Treg所占CD4+T细胞比值下降(P＜0.05).sTNFR1-Ig封闭TNF-α对MC免疫毒性作用的浓度效应明显,而EGFP-MCs与对照细胞上清对TNF-α毒性效应的中和阻断能力不足(P＜0.05).结论 携sTNFR1-Ig基因重组腺病毒参与的免疫调控与妊娠期哮喘发生发展密切相关.sTNFR1及IgGFc亚基胞膜外区结合的表达和引起免疫耐受的作用研究,为妊娠哮喘发病机制在理论上的新突破,为以sTNFRI-Ig为靶点的妊娠哮喘干预治疗奠定基础.
目的 構建攜帶人sTNFR1與IgGFc片段融閤基因的重組腺病毒,穩定錶達併初步鑒定其功能活性在妊娠哮喘炎癥機製中的作用.方法 將PCR擴增的sTNFR1及IgGFc基因片段先後連接到穿梭質粒pAdTrack-CMV多剋隆位點上,酶切線性化後在BJ5183細菌內與骨架質粒pAdEasy-1同源重組,產生穫得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂質體法轉染AD293細胞進行病毒包裝,以綠色熒光蛋白(GFP)鑑測病毒滴度及感染效率.RT-PCR、Western blot實驗鑒定細胞內重組腺病毒轉錄及融閤基因與蛋白錶達;流式細胞術、ELISA實驗分析混閤培養上清中轉染肥大細胞(MC)激活、調節同基因來源T細胞錶達Th2/Treg水平及細胞因子分泌效果;MTT評估轉染細胞上清中sTNFR1-Ig對TNF-α介導細胞毒效應的拮抗作用.結果 成功構建編碼sTNFR1-Ig基因的重組腺病毒載體經酶切和測序鑒定正確,製備的腺病毒在轉染細胞中的GFP錶達以及CPE效應明顯,擴增後的滴度為3.7×1010～4.8×1010 pfu/ml,體外感染效率可達90%以上;sTNFR1-Ig基因在 mRNA 及蛋白水平穫得的清晰條帶均證實腺病毒包裝與擴增成功.錶達sTNFR1-Ig的MC誘導T細胞轉化為CD4+CD25+Foxp3+T細胞水平以及IL-12含量均明顯升高,CD4+IL-4+Th2細胞水平下調(P＜0.05),Th2/Treg所佔CD4+T細胞比值下降(P＜0.05).sTNFR1-Ig封閉TNF-α對MC免疫毒性作用的濃度效應明顯,而EGFP-MCs與對照細胞上清對TNF-α毒性效應的中和阻斷能力不足(P＜0.05).結論 攜sTNFR1-Ig基因重組腺病毒參與的免疫調控與妊娠期哮喘髮生髮展密切相關.sTNFR1及IgGFc亞基胞膜外區結閤的錶達和引起免疫耐受的作用研究,為妊娠哮喘髮病機製在理論上的新突破,為以sTNFRI-Ig為靶點的妊娠哮喘榦預治療奠定基礎.
목적 구건휴대인sTNFR1여IgGFc편단융합기인적중조선병독,은정표체병초보감정기공능활성재임신효천염증궤제중적작용.방법 장PCR확증적sTNFR1급IgGFc기인편단선후련접도천사질립pAdTrack-CMV다극륭위점상,매절선성화후재BJ5183세균내여골가질립pAdEasy-1동원중조,산생획득적AdE-EGFP-sTNFR1-Ig이지질체법전염AD293세포진행병독포장,이록색형광단백(GFP)감측병독적도급감염효솔.RT-PCR、Western blot실험감정세포내중조선병독전록급융합기인여단백표체;류식세포술、ELISA실험분석혼합배양상청중전염비대세포(MC)격활、조절동기인래원T세포표체Th2/Treg수평급세포인자분비효과;MTT평고전염세포상청중sTNFR1-Ig대TNF-α개도세포독효응적길항작용.결과 성공구건편마sTNFR1-Ig기인적중조선병독재체경매절화측서감정정학,제비적선병독재전염세포중적GFP표체이급CPE효응명현,확증후적적도위3.7×1010～4.8×1010 pfu/ml,체외감염효솔가체90%이상;sTNFR1-Ig기인재 mRNA 급단백수평획득적청석조대균증실선병독포장여확증성공.표체sTNFR1-Ig적MC유도T세포전화위CD4+CD25+Foxp3+T세포수평이급IL-12함량균명현승고,CD4+IL-4+Th2세포수평하조(P＜0.05),Th2/Treg소점CD4+T세포비치하강(P＜0.05).sTNFR1-Ig봉폐TNF-α대MC면역독성작용적농도효응명현,이EGFP-MCs여대조세포상청대TNF-α독성효응적중화조단능력불족(P＜0.05).결론 휴sTNFR1-Ig기인중조선병독삼여적면역조공여임신기효천발생발전밀절상관.sTNFR1급IgGFc아기포막외구결합적표체화인기면역내수적작용연구,위임신효천발병궤제재이론상적신돌파,위이sTNFRI-Ig위파점적임신효천간예치료전정기출.
