中国实验血液学杂志
中國實驗血液學雜誌
중국실험혈액학잡지
JOURNAL OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY
2012年
5期
1056-1062
,共7页
吴顺泉%徐珍珍%林君%战榕
吳順泉%徐珍珍%林君%戰榕
오순천%서진진%림군%전용
miR-20a%miRNA海绵%Jurkat细胞
miR-20a%miRNA海綿%Jurkat細胞
miR-20a%miRNA해면%Jurkat세포
本研究构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立Jurkat-S稳定细胞株,为进一步研究的miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础.设计、合成1对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列,并带有酶切位点,退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上；载体双酶切后再与退火产物连接,重复4次后进行酶切及荧光素酶活性鉴定；亚克隆到慢病毒表达载体,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染Jurkat细胞,建立稳定细胞株；应用实时PCR和Western blot技术分别检测Jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较.结果表明,成功构建了针对miR-20a基因的海绵载体,病毒滴度为5×107TU/ml;建立了稳定转染的Jurkat-S细胞株.有效干扰验证显示,miR-20a海绵能明显上调P21及E2F1的mRNA及蛋白表达水平,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立稳定干扰miR-20a表达的Jurkat-S细胞株.
本研究構建miR-20a基因的miRNA海綿載體,建立Jurkat-S穩定細胞株,為進一步研究的miR-20a功能及應用榦擾技術治療奠定基礎.設計、閤成1對含有2箇重複針對miR-20a成熟序列第9-12堿基錯配的序列,併帶有酶切位點,退火後連接到pCDNA3.0-L錶達載體上；載體雙酶切後再與退火產物連接,重複4次後進行酶切及熒光素酶活性鑒定；亞剋隆到慢病毒錶達載體,與psPAX2、PMD2G共轉染HEK 293T細胞,包裝產生慢病毒顆粒併測定病毒滴度,感染Jurkat細胞,建立穩定細胞株；應用實時PCR和Western blot技術分彆檢測Jurkat-S穩定細胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白的錶達,併與對照組進行比較.結果錶明,成功構建瞭針對miR-20a基因的海綿載體,病毒滴度為5×107TU/ml;建立瞭穩定轉染的Jurkat-S細胞株.有效榦擾驗證顯示,miR-20a海綿能明顯上調P21及E2F1的mRNA及蛋白錶達水平,差異有統計學意義(P＜0.05).結論:成功構建miR-20a基因的miRNA海綿載體,建立穩定榦擾miR-20a錶達的Jurkat-S細胞株.
본연구구건miR-20a기인적miRNA해면재체,건립Jurkat-S은정세포주,위진일보연구적miR-20a공능급응용간우기술치료전정기출.설계、합성1대함유2개중복침대miR-20a성숙서렬제9-12감기착배적서렬,병대유매절위점,퇴화후련접도pCDNA3.0-L표체재체상；재체쌍매절후재여퇴화산물련접,중복4차후진행매절급형광소매활성감정；아극륭도만병독표체재체,여psPAX2、PMD2G공전염HEK 293T세포,포장산생만병독과립병측정병독적도,감염Jurkat세포,건립은정세포주；응용실시PCR화Western blot기술분별검측Jurkat-S은정세포중P21급E2F1 mRNA화단백적표체,병여대조조진행비교.결과표명,성공구건료침대miR-20a기인적해면재체,병독적도위5×107TU/ml;건립료은정전염적Jurkat-S세포주.유효간우험증현시,miR-20a해면능명현상조P21급E2F1적mRNA급단백표체수평,차이유통계학의의(P＜0.05).결론:성공구건miR-20a기인적miRNA해면재체,건립은정간우miR-20a표체적Jurkat-S세포주.
