中国实验血液学杂志
中國實驗血液學雜誌
중국실험혈액학잡지
JOURNAL OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY
2013年
1期
209-213
,共5页
陈麟凤%张杰%杨嘉慧%罗圆圆%庄远%李卉%冯倩%汪德清
陳麟鳳%張傑%楊嘉慧%囉圓圓%莊遠%李卉%馮倩%汪德清
진린봉%장걸%양가혜%라원원%장원%리훼%풍천%왕덕청
CD36抗原%血小板输注无效%真核载体%蛋白表达
CD36抗原%血小闆輸註無效%真覈載體%蛋白錶達
CD36항원%혈소판수주무효%진핵재체%단백표체
本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体.提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30-Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒.经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 His真核瞬时表达载体.采用lipofectamine 2000转染法,将重组质粒转染至HEK293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化.以制备的重组CD36蛋白免疫BALB/c小鼠后,取脾与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆,行Western blot检测抗体结合活性.结果显示:RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段.经测序,该序列分析结果与GenBank中的NM_001001547.2完全一致.SDS-PAGE证实转染的HEK293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段.鼠单克隆抗体在Western blot中可以识别重组CD36蛋白,灵敏度达到8 ng.结论:成功制备了抗人血小板CD36单克隆抗体,为临床筛选CD36阴性患者及献血员、深入研究人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效的影响提供了实验基础.
本研究旨在製備具有功能活性的重組人血小闆錶麵CD36抗原的鼠抗人單剋隆抗體.提取人肝細胞總RNA,經RT-PCR擴增編碼人血小闆CD36抗原胞外區(Gly30-Asn439)氨基痠殘基cDNA,構建于原覈錶達載體pMD18併轉化大腸桿菌DH5α,篩選穫得暘性重組子pMD18-CD36,提取質粒.經序列測定後,將該基因插入到真覈細胞瞬時錶達載體pTE2上,構建成為pTE2-s-CD36-10 His真覈瞬時錶達載體.採用lipofectamine 2000轉染法,將重組質粒轉染至HEK293細胞,錶達產物經Ni2+2NTA柱層析純化.以製備的重組CD36蛋白免疫BALB/c小鼠後,取脾與小鼠骨髓瘤細胞融閤,篩選齣暘性剋隆,行Western blot檢測抗體結閤活性.結果顯示:RT-PCR擴增穫得瞭1.4 kb的片段.經測序,該序列分析結果與GenBank中的NM_001001547.2完全一緻.SDS-PAGE證實轉染的HEK293細胞錶達瞭人CD36抗原胞外區蛋白片段.鼠單剋隆抗體在Western blot中可以識彆重組CD36蛋白,靈敏度達到8 ng.結論:成功製備瞭抗人血小闆CD36單剋隆抗體,為臨床篩選CD36陰性患者及獻血員、深入研究人血小闆CD36錶麵抗原對血小闆輸註無效的影響提供瞭實驗基礎.
본연구지재제비구유공능활성적중조인혈소판표면CD36항원적서항인단극륭항체.제취인간세포총RNA,경RT-PCR확증편마인혈소판CD36항원포외구(Gly30-Asn439)안기산잔기cDNA,구건우원핵표체재체pMD18병전화대장간균DH5α,사선획득양성중조자pMD18-CD36,제취질립.경서렬측정후,장해기인삽입도진핵세포순시표체재체pTE2상,구건성위pTE2-s-CD36-10 His진핵순시표체재체.채용lipofectamine 2000전염법,장중조질립전염지HEK293세포,표체산물경Ni2+2NTA주층석순화.이제비적중조CD36단백면역BALB/c소서후,취비여소서골수류세포융합,사선출양성극륭,행Western blot검측항체결합활성.결과현시:RT-PCR확증획득료1.4 kb적편단.경측서,해서렬분석결과여GenBank중적NM_001001547.2완전일치.SDS-PAGE증실전염적HEK293세포표체료인CD36항원포외구단백편단.서단극륭항체재Western blot중가이식별중조CD36단백,령민도체도8 ng.결론:성공제비료항인혈소판CD36단극륭항체,위림상사선CD36음성환자급헌혈원、심입연구인혈소판CD36표면항원대혈소판수주무효적영향제공료실험기출.
