中国实验血液学杂志
中國實驗血液學雜誌
중국실험혈액학잡지
JOURNAL OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY
2013年
1期
198-202
,共5页
李淼%陈伟%安新江%曹军华%范从海%尹力扬%张春霞%孙浩淼
李淼%陳偉%安新江%曹軍華%範從海%尹力颺%張春霞%孫浩淼
리묘%진위%안신강%조군화%범종해%윤력양%장춘하%손호묘
CXC型趋化因子受体4%慢病毒载体%基因表达%293FT细胞
CXC型趨化因子受體4%慢病毒載體%基因錶達%293FT細胞
CXC형추화인자수체4%만병독재체%기인표체%293FT세포
本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4(CXCR4)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CXCR4重组慢病毒栽体并在真核细胞中表达.采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移栽体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒；同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒；通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达.结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293Fr细胞后获得病毒滴度可达到108 TU/ml.以重组慢病毒颗粒感染293FT细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293FT细胞表达CXCR4蛋白.结论:成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达.
本研究旨在剋隆小鼠CXC型趨化因子受體4(CXCR4)基因,構建攜帶增彊型綠色熒光蛋白(EGFP)的CXCR4重組慢病毒栽體併在真覈細胞中錶達.採用逆轉錄-聚閤酶鏈式反應(RT-PCR)以C57BL/6小鼠骨髓細胞為模闆剋隆全長型CXCR4基因,連接至剋隆載體pCR-Blunt,經限製性內切酶酶切後亞剋隆至慢病毒轉移栽體,構建攜帶EGFP及CXCR4雙順反子結構的自身失活型重組慢病毒錶達質粒；同時構建LV-IRES-EGFP作為對照質粒；通過脂質體轉染法與包裝質粒及包膜蛋白質粒共轉染包裝細胞293FT,超速離心濃縮病毒顆粒後轉染293FT細胞,採用熒光顯微鏡和流式細胞術(FCM)檢測EGFP的錶達,Western blot鑒定CXCR4蛋白錶達.結果錶明,成功剋隆小鼠CXCR4基因,構建重組慢病毒轉移質粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及對照質粒LV-IRES-EGFP,三質粒繫統共轉染293Fr細胞後穫得病毒滴度可達到108 TU/ml.以重組慢病毒顆粒感染293FT細胞後第3天,在熒光顯微鏡下觀察到較彊綠色熒光錶達,FCM檢測顯示感染效率可達95％,FCM及Western blot結果顯示感染後293FT細胞錶達CXCR4蛋白.結論:成功構建自身失活型慢病毒載體LV-IRES-EGFP-CXCR4,併在真覈細胞中穫得錶達.
본연구지재극륭소서CXC형추화인자수체4(CXCR4)기인,구건휴대증강형록색형광단백(EGFP)적CXCR4중조만병독재체병재진핵세포중표체.채용역전록-취합매련식반응(RT-PCR)이C57BL/6소서골수세포위모판극륭전장형CXCR4기인,련접지극륭재체pCR-Blunt,경한제성내절매매절후아극륭지만병독전이재체,구건휴대EGFP급CXCR4쌍순반자결구적자신실활형중조만병독표체질립；동시구건LV-IRES-EGFP작위대조질립；통과지질체전염법여포장질립급포막단백질립공전염포장세포293FT,초속리심농축병독과립후전염293FT세포,채용형광현미경화류식세포술(FCM)검측EGFP적표체,Western blot감정CXCR4단백표체.결과표명,성공극륭소서CXCR4기인,구건중조만병독전이질립LV-IRES-EGFP-CXCR4급대조질립LV-IRES-EGFP,삼질립계통공전염293Fr세포후획득병독적도가체도108 TU/ml.이중조만병독과립감염293FT세포후제3천,재형광현미경하관찰도교강록색형광표체,FCM검측현시감염효솔가체95％,FCM급Western blot결과현시감염후293FT세포표체CXCR4단백.결론:성공구건자신실활형만병독재체LV-IRES-EGFP-CXCR4,병재진핵세포중획득표체.
