中华神经外科疾病研究杂志
中華神經外科疾病研究雜誌
중화신경외과질병연구잡지
CHINESE JOURNAL OF NEUROSURGICAL DISEASE RESEARCH
2013年
2期
126-129
,共4页
李晓明%林伟%章翔%王江%张璟%张健%韩腾龙%药立波
李曉明%林偉%章翔%王江%張璟%張健%韓騰龍%藥立波
리효명%림위%장상%왕강%장경%장건%한등룡%약립파
分化型胚胎软骨发育基因1%GatewayTM系统%慢病毒表达载体%神经胶质瘤
分化型胚胎軟骨髮育基因1%GatewayTM繫統%慢病毒錶達載體%神經膠質瘤
분화형배태연골발육기인1%GatewayTM계통%만병독표체재체%신경효질류
目的 利用GatewayTM技术构建分化型胚胎软骨发育基因1(Dec1)的慢病毒表达载体并建立稳定表达该目的基因的人胶质瘤U87细胞株.方法 从人脑胶质瘤组织中提取总RNA,经反转录得到目的cDNA.设计含有特异性酶切位点的引物,通过逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR),获得用于重组的Dec1目的基因全长.将目的片段克隆至入门载体(pENTRTM 3C)中产生入门克隆.利用GatewayTM技术,将入门克隆中的目的片段转接于目的载体(pLenti6.3/V5-DEST)中产生表达克隆pLenti6.3-Dec1.在293T细胞中包装慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1并转染U87细胞,通过灭瘟素筛选、Western blot鉴定,获得稳定表达Dec1的U87细胞株.结果 Dec1基因全长的获取与慢病毒表达载体pLenti6.3-Dec1的构建经PCR和测序得到证实.用pLenti6.3-Dec1转染U87细胞后,通过灭瘟素筛选,获得稳定表达Dec1的U87细胞株.结论 成功构建了pLenti6.3-Dec1慢病毒表达载体并建立稳定表达Dec1的人胶质瘤U87细胞株,为深入研究Dec1分子机制奠定了基础.
目的 利用GatewayTM技術構建分化型胚胎軟骨髮育基因1(Dec1)的慢病毒錶達載體併建立穩定錶達該目的基因的人膠質瘤U87細胞株.方法 從人腦膠質瘤組織中提取總RNA,經反轉錄得到目的cDNA.設計含有特異性酶切位點的引物,通過逆轉錄酶-多聚酶鏈反應(RT-PCR),穫得用于重組的Dec1目的基因全長.將目的片段剋隆至入門載體(pENTRTM 3C)中產生入門剋隆.利用GatewayTM技術,將入門剋隆中的目的片段轉接于目的載體(pLenti6.3/V5-DEST)中產生錶達剋隆pLenti6.3-Dec1.在293T細胞中包裝慢病毒錶達載體pLenti6.3-Dec1併轉染U87細胞,通過滅瘟素篩選、Western blot鑒定,穫得穩定錶達Dec1的U87細胞株.結果 Dec1基因全長的穫取與慢病毒錶達載體pLenti6.3-Dec1的構建經PCR和測序得到證實.用pLenti6.3-Dec1轉染U87細胞後,通過滅瘟素篩選,穫得穩定錶達Dec1的U87細胞株.結論 成功構建瞭pLenti6.3-Dec1慢病毒錶達載體併建立穩定錶達Dec1的人膠質瘤U87細胞株,為深入研究Dec1分子機製奠定瞭基礎.
목적 이용GatewayTM기술구건분화형배태연골발육기인1(Dec1)적만병독표체재체병건립은정표체해목적기인적인효질류U87세포주.방법 종인뇌효질류조직중제취총RNA,경반전록득도목적cDNA.설계함유특이성매절위점적인물,통과역전록매-다취매련반응(RT-PCR),획득용우중조적Dec1목적기인전장.장목적편단극륭지입문재체(pENTRTM 3C)중산생입문극륭.이용GatewayTM기술,장입문극륭중적목적편단전접우목적재체(pLenti6.3/V5-DEST)중산생표체극륭pLenti6.3-Dec1.재293T세포중포장만병독표체재체pLenti6.3-Dec1병전염U87세포,통과멸온소사선、Western blot감정,획득은정표체Dec1적U87세포주.결과 Dec1기인전장적획취여만병독표체재체pLenti6.3-Dec1적구건경PCR화측서득도증실.용pLenti6.3-Dec1전염U87세포후,통과멸온소사선,획득은정표체Dec1적U87세포주.결론 성공구건료pLenti6.3-Dec1만병독표체재체병건립은정표체Dec1적인효질류U87세포주,위심입연구Dec1분자궤제전정료기출.
