医学研究生学报
醫學研究生學報
의학연구생학보
JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATE
2014年
2期
120-123
,共4页
杜骁杰%郭静静%王晶%李敏%王玲%王长军%潘秀珍
杜驍傑%郭靜靜%王晶%李敏%王玲%王長軍%潘秀珍
두효걸%곽정정%왕정%리민%왕령%왕장군%반수진
2型猪链球菌%链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶%原核表达%酶活鉴定
2型豬鏈毬菌%鏈毬菌絲氨痠/囌氨痠燐痠酶%原覈錶達%酶活鑒定
2형저련구균%련구균사안산/소안산린산매%원핵표체%매활감정
Streptococcus suis serotype 2%Serine/threonine phosphotase%Prokaryotic expression%Phosphatase assays
目的 链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的磷酸化信号调控系统成员之一.文中对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP编码基因stp进行原核表达并对纯化蛋白进行酶活测定.方法对S.suis 2 stp进行生物信息学分析,PCR扩增stp基因片段,构建重组表达载体pET28a::stp.将载体转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)为底物测定其水解量进而鉴定磷酸酶活性.结果 从05ZYH33基因组中PCR扩增到810bp的片段,经连接获得重组表达载体pET28a::stp;经诱导表达及纯化获得相对分子质量为32000的重组蛋白,该蛋白在Mn2+存在下能够水解pNpp.结论获得纯度较高的STP重组蛋白,该蛋白具有Mn2+依赖的磷酸酶活性,为后续阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础.
目的 鏈毬菌絲氨痠/囌氨痠燐痠酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的燐痠化信號調控繫統成員之一.文中對2型豬鏈毬菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP編碼基因stp進行原覈錶達併對純化蛋白進行酶活測定.方法對S.suis 2 stp進行生物信息學分析,PCR擴增stp基因片段,構建重組錶達載體pET28a::stp.將載體轉入E.coli BL21中,經IPTG誘導,Ni2+親和層析柱純化重組蛋白,SDS-PAGE和Western blot鑒定,利用燐痠對硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)為底物測定其水解量進而鑒定燐痠酶活性.結果 從05ZYH33基因組中PCR擴增到810bp的片段,經連接穫得重組錶達載體pET28a::stp;經誘導錶達及純化穫得相對分子質量為32000的重組蛋白,該蛋白在Mn2+存在下能夠水解pNpp.結論穫得純度較高的STP重組蛋白,該蛋白具有Mn2+依賴的燐痠酶活性,為後續闡明STK/STP燐痠化繫統的調控機製打下基礎.
목적 련구균사안산/소안산린산매(serine/threonine phosphotase,STP)시중요적린산화신호조공계통성원지일.문중대2형저련구균(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP편마기인stp진행원핵표체병대순화단백진행매활측정.방법대S.suis 2 stp진행생물신식학분석,PCR확증stp기인편단,구건중조표체재체pET28a::stp.장재체전입E.coli BL21중,경IPTG유도,Ni2+친화층석주순화중조단백,SDS-PAGE화Western blot감정,이용린산대초기분지(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)위저물측정기수해량진이감정린산매활성.결과 종05ZYH33기인조중PCR확증도810bp적편단,경련접획득중조표체재체pET28a::stp;경유도표체급순화획득상대분자질량위32000적중조단백,해단백재Mn2+존재하능구수해pNpp.결론획득순도교고적STP중조단백,해단백구유Mn2+의뢰적린산매활성,위후속천명STK/STP린산화계통적조공궤제타하기출.
