CAJ | 학술논문

目的研究γ干扰素(IFN-γ)活化的THP-1源巨噬细胞对BCG的杀伤作用,并探讨其杀伤机制是否与自噬有关.方法 Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,也称佛波酯)诱导THP 1分化成巨噬细胞.牛分枝杆菌减毒株荧光BCG以感染复数MOI(multiplicity of infection,细菌数与细胞数的比例)10∶1感染未活化(Control组)、IFN-γ活化(IFN γ组)、Rapamycin诱导自噬(Rapa组)、3甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬(IFN-γ+3-MA组)4组不同预处理的巨噬细胞.感染48 h后,超纯水裂解细胞,收集裂解液和培养上清混合,相同比例取各组混合液10μl,连续10倍稀释3次涂7H10平板培养基,置37℃生化培养箱培养,第3至4周观察记录菌落数,计算生存率[control组的菌落数为分母,其他组(包括control组)的菌落数为分子相除得到的数值为生存率].同时在感染过程的不同时间点裂解细胞提取总蛋白,以Western blot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达,监测细胞自噬水平的变化.实验结果数据以3次重复实验数据的“(-x)±s”形式展示(Western blot结果除外,只采用其中一个结果数据为代表).用SPSS 17.0软件进行统计分析:巨噬细胞贴壁率比较和凋亡率比较用两独立样本t检验;巨噬细胞活化后不同时间点分泌的TNF-α浓度比较和BCG感染各组巨噬细胞后的生存率比较用One-Way ANOVA检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 BCG感染各组巨噬细胞48 h后的生存率:Control组为(100％±0％),IFN-γ组(45％±3％),Rapa组(48％±3％),IFN-γ+ 3-MA组(91％±2％).BCG生存率经One-Way ANOVA检验,与Control组(未活化组)比较:IFN-γ组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;Rapa组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;IFN-γ+ 3-MA组BCG生存率无下降(P=0.13),细胞自噬水平无增高.结论 BCG感染巨噬细胞,或者说巨噬细胞吞噬BCG,两者的相互作用微妙而复杂.巨噬细胞在IFN-γ活化期间遭遇BCG,可以明显杀伤BCG,杀伤机制与自噬有关. 目的研究γ榦擾素(IFN-γ)活化的THP-1源巨噬細胞對BCG的殺傷作用,併探討其殺傷機製是否與自噬有關.方法 Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,也稱彿波酯)誘導THP 1分化成巨噬細胞.牛分枝桿菌減毒株熒光BCG以感染複數MOI(multiplicity of infection,細菌數與細胞數的比例)10∶1感染未活化(Control組)、IFN-γ活化(IFN γ組)、Rapamycin誘導自噬(Rapa組)、3甲基腺嘌呤(3-MA)抑製自噬(IFN-γ+3-MA組)4組不同預處理的巨噬細胞.感染48 h後,超純水裂解細胞,收集裂解液和培養上清混閤,相同比例取各組混閤液10μl,連續10倍稀釋3次塗7H10平闆培養基,置37℃生化培養箱培養,第3至4週觀察記錄菌落數,計算生存率[control組的菌落數為分母,其他組(包括control組)的菌落數為分子相除得到的數值為生存率].同時在感染過程的不同時間點裂解細胞提取總蛋白,以Western blot方法檢測自噬標誌蛋白LC3B的錶達,鑑測細胞自噬水平的變化.實驗結果數據以3次重複實驗數據的“(-x)±s”形式展示(Western blot結果除外,隻採用其中一箇結果數據為代錶).用SPSS 17.0軟件進行統計分析:巨噬細胞貼壁率比較和凋亡率比較用兩獨立樣本t檢驗;巨噬細胞活化後不同時間點分泌的TNF-α濃度比較和BCG感染各組巨噬細胞後的生存率比較用One-Way ANOVA檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義.結果 BCG感染各組巨噬細胞48 h後的生存率:Control組為(100％±0％),IFN-γ組(45％±3％),Rapa組(48％±3％),IFN-γ+ 3-MA組(91％±2％).BCG生存率經One-Way ANOVA檢驗,與Control組(未活化組)比較:IFN-γ組BCG生存率明顯下降(P=0.01),細胞自噬水平明顯增高;Rapa組BCG生存率明顯下降(P=0.01),細胞自噬水平明顯增高;IFN-γ+ 3-MA組BCG生存率無下降(P=0.13),細胞自噬水平無增高.結論 BCG感染巨噬細胞,或者說巨噬細胞吞噬BCG,兩者的相互作用微妙而複雜.巨噬細胞在IFN-γ活化期間遭遇BCG,可以明顯殺傷BCG,殺傷機製與自噬有關.
목적 연구γ간우소(IFN-γ)활화적THP-1원거서세포대BCG적살상작용,병탐토기살상궤제시부여자서유관.방법 Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,야칭불파지)유도THP 1분화성거서세포.우분지간균감독주형광BCG이감염복수MOI(multiplicity of infection,세균수여세포수적비례)10∶1감염미활화(Control조)、IFN-γ활화(IFN γ조)、Rapamycin유도자서(Rapa조)、3갑기선표령(3-MA)억제자서(IFN-γ+3-MA조)4조불동예처리적거서세포.감염48 h후,초순수렬해세포,수집렬해액화배양상청혼합,상동비례취각조혼합액10μl,련속10배희석3차도7H10평판배양기,치37℃생화배양상배양,제3지4주관찰기록균락수,계산생존솔[control조적균락수위분모,기타조(포괄control조)적균락수위분자상제득도적수치위생존솔].동시재감염과정적불동시간점렬해세포제취총단백,이Western blot방법검측자서표지단백LC3B적표체,감측세포자서수평적변화.실험결과수거이3차중복실험수거적“(-x)±s”형식전시(Western blot결과제외,지채용기중일개결과수거위대표).용SPSS 17.0연건진행통계분석:거서세포첩벽솔비교화조망솔비교용량독립양본t검험;거서세포활화후불동시간점분비적TNF-α농도비교화BCG감염각조거서세포후적생존솔비교용One-Way ANOVA검험,이P＜0.05위차이유통계학의의.결과 BCG감염각조거서세포48 h후적생존솔:Control조위(100％±0％),IFN-γ조(45％±3％),Rapa조(48％±3％),IFN-γ+ 3-MA조(91％±2％).BCG생존솔경One-Way ANOVA검험,여Control조(미활화조)비교:IFN-γ조BCG생존솔명현하강(P=0.01),세포자서수평명현증고;Rapa조BCG생존솔명현하강(P=0.01),세포자서수평명현증고;IFN-γ+ 3-MA조BCG생존솔무하강(P=0.13),세포자서수평무증고.결론 BCG감염거서세포,혹자설거서세포탄서BCG,량자적상호작용미묘이복잡.거서세포재IFN-γ활화기간조우BCG,가이명현살상BCG,살상궤제여자서유관.