CAJ | 학술논문

目的 ALKBH2基因高表达于尿路上皮肿瘤,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术难以稳定均一性的下调靶基因.文中旨在构建人源ABH2基因shRNA干扰慢病毒表达载体并进行鉴定. 方法选取ABH2基因,分析该基因的编码区序列,进行单链oligo的设计及合成,利用PCR对合成的oligo进行拼接反应,将合成好的序列装入pcDNA3.1(+)载体并转化至感受态细胞DH5α,测序鉴定重组克隆中基因序列后构建表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2.根据不同的载体分为4组:siRNA-468组、siRNA-571组、siRNA-662组和对照组.根据靶基因序列设计并合成3对shRNA,构建入U6载体.将shRNA载体分别与表达载体共转染人HEK293细胞,通过QPCR检测筛选出最优干扰序列.将筛选到最有效的shRNA-571干扰序列构建人慢病毒载体pL/shRNA/F载体,用构建的慢病毒干扰载体和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度.将LV-shRNA-571与过表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2共转染肾癌细胞株ACHN,通过QPCR鉴定干扰效果. 结果克隆测序验证无误,慢病毒载体构建成功.转染实验48h后,收集293细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为1.1×10sTU/mL.对照组ABH2mRNA相对表达量为0.785 ±0.082,siRNA-571组为0.078 ±0.006,RNAi后ABH2基因的mRNA表达水平(0.078 ±0.006)与对照组(0.785 ±0.082)相比显著降低(P＜0.01),慢病毒PL/shRNA/F-ALKBH2-571对目的基因ABH2的干扰效率为92.2％. 结论成功构建ABH2基因RNAi慢病毒载体并得到鉴定.
목적 ALKBH2기인고표체우뇨로상피종류,RNA간우(RNA interference,RNAi)기술난이은정균일성적하조파기인.문중지재구건인원ABH2기인shRNA간우만병독표체재체병진행감정. 방법 선취ABH2기인,분석해기인적편마구서렬,진행단련oligo적설계급합성,이용PCR대합성적oligo진행병접반응,장합성호적서렬장입pcDNA3.1(+)재체병전화지감수태세포DH5α,측서감정중조극륭중기인서렬후구건표체재체pcDNA3.1(+)/ABH2.근거불동적재체분위4조:siRNA-468조、siRNA-571조、siRNA-662조화대조조.근거파기인서렬설계병합성3대shRNA,구건입U6재체.장shRNA재체분별여표체재체공전염인HEK293세포,통과QPCR검측사선출최우간우서렬.장사선도최유효적shRNA-571간우서렬구건인만병독재체pL/shRNA/F재체,용구건적만병독간우재체화포장질립공전염293T세포,포장병독,수집병독원액,초속리심농축,병측정적도.장LV-shRNA-571여과표체재체pcDNA3.1(+)/ABH2공전염신암세포주ACHN,통과QPCR감정간우효과. 결과 극륭측서험증무오,만병독재체구건성공.전염실험48h후,수집293세포분비적병독상청측정병독적적도위1.1×10sTU/mL.대조조ABH2mRNA상대표체량위0.785 ±0.082,siRNA-571조위0.078 ±0.006,RNAi후ABH2기인적mRNA표체수평(0.078 ±0.006)여대조조(0.785 ±0.082)상비현저강저(P＜0.01),만병독PL/shRNA/F-ALKBH2-571대목적기인ABH2적간우효솔위92.2％. 결론 성공구건ABH2기인RNAi만병독재체병득도감정.