浙江大学学报（医学版）
浙江大學學報（醫學版）
절강대학학보（의학판）
JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSITY MEDICAL SCIENCES
2013年
6期
654-659
,共6页
哈小琴%姜东红%邓芝云%董菊子%赵勇%彭俊华%杨志华
哈小琴%薑東紅%鄧芝雲%董菊子%趙勇%彭俊華%楊誌華
합소금%강동홍%산지운%동국자%조용%팽준화%양지화
低氧诱导因子-1α%遗传载体%内皮细胞%重组,遗传%基因表达
低氧誘導因子-1α%遺傳載體%內皮細胞%重組,遺傳%基因錶達
저양유도인자-1α%유전재체%내피세포%중조,유전%기인표체
Hypoxia inducible factor 1 α%Genetic vectors%Endothelial cells%Recombination,genetic%Gene expression
目的:构建携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF),观察其在内皮细胞中的表达.方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA,以之作为模板,依据基因库公布的HIF-1 αcDNA设计引物,分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF.采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体.检测重组腺病毒效价后,转染人脐静脉内皮细胞ECV304,检测目的基因的转染表达.结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-1α基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、效价高.以100 MOI转染ECV304细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,转染48 h时荧光表达更强,且培养上清液中HIF-1蛋白表达水平为(48.93±3.86) ng/mL.结论:本实验构建的携带HIF-1α基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高,有望应用于缺血缺氧组织局部.
目的:構建攜帶低氧誘導因子-1α(HIF-1α)基因的腺病毒載體(pAdxsi-GFP-HIF),觀察其在內皮細胞中的錶達.方法:低氧處理A549細胞後提取總RNA併逆轉錄為cDNA,以之作為模闆,依據基因庫公佈的HIF-1 αcDNA設計引物,分彆引入KpnI和BamHI酶切位點,PCR擴增後將目的基因HIF-1α連接到載體pShuttle-CMV-EGFP上,構建穿梭質粒pShuttle-GFP-HIF.採用細菌內重組方法將目的序列重組到pAdxsi病毒骨架載體上構建攜帶HIF-1α基因的重組腺病毒載體.檢測重組腺病毒效價後,轉染人臍靜脈內皮細胞ECV304,檢測目的基因的轉染錶達.結果:通過對構建質粒剋隆進行測序及酶切,證實攜帶HIF-1α基因的重組腺病毒載體pAdxsi-GFP-HIF構建成功,且構建的重組腺病毒純度好、效價高.以100 MOI轉染ECV304細胞24 h後在熒光顯微鏡下可觀察到細胞有較彊的綠色熒光錶達,轉染48 h時熒光錶達更彊,且培養上清液中HIF-1蛋白錶達水平為(48.93±3.86) ng/mL.結論:本實驗構建的攜帶HIF-1α基因的腺病毒載體pAdxsi-GFP-HIF轉染效率及目的基因的蛋白錶達水平均較高,有望應用于缺血缺氧組織跼部.
목적:구건휴대저양유도인자-1α(HIF-1α)기인적선병독재체(pAdxsi-GFP-HIF),관찰기재내피세포중적표체.방법:저양처리A549세포후제취총RNA병역전록위cDNA,이지작위모판,의거기인고공포적HIF-1 αcDNA설계인물,분별인입KpnI화BamHI매절위점,PCR확증후장목적기인HIF-1α련접도재체pShuttle-CMV-EGFP상,구건천사질립pShuttle-GFP-HIF.채용세균내중조방법장목적서렬중조도pAdxsi병독골가재체상구건휴대HIF-1α기인적중조선병독재체.검측중조선병독효개후,전염인제정맥내피세포ECV304,검측목적기인적전염표체.결과:통과대구건질립극륭진행측서급매절,증실휴대HIF-1α기인적중조선병독재체pAdxsi-GFP-HIF구건성공,차구건적중조선병독순도호、효개고.이100 MOI전염ECV304세포24 h후재형광현미경하가관찰도세포유교강적록색형광표체,전염48 h시형광표체경강,차배양상청액중HIF-1단백표체수평위(48.93±3.86) ng/mL.결론:본실험구건적휴대HIF-1α기인적선병독재체pAdxsi-GFP-HIF전염효솔급목적기인적단백표체수평균교고,유망응용우결혈결양조직국부.
