华中科技大学学报（医学版）
華中科技大學學報（醫學版）
화중과기대학학보（의학판）
ACTA UNIVERSITATIS MEDICINAE TONGJI
2013年
2期
167-171
,共5页
喻钧%潘铁成%魏翔%刘立刚%胡敏
喻鈞%潘鐵成%魏翔%劉立剛%鬍敏
유균%반철성%위상%류립강%호민
Toll样受体3%RNA干扰%慢病毒%肺腺癌
Toll樣受體3%RNA榦擾%慢病毒%肺腺癌
Toll양수체3%RNA간우%만병독%폐선암
目的 观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人肺腺癌细胞株A549细胞Toll样受体3( Toll-like receptor 3,TLR3 )表达的影响,为后续的以TLR3基因为靶点的肺癌研究和治疗奠定基础.方法 应用基因工程技术,筛选出4条针对TLR3基因的RNAi靶序列,分别与pCCL-GFP载体连接,构建4个重组慢病毒表达载体TLR3-RNAi-LV 1#,TLR3-RNAi-LV 2#,TLR3-RNAi-LV 3#,TLR3-RNAi-LV 4#;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将TLR3-RNAi-LV、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的4种重组慢病毒分别感染A549细胞,实时定量PCR和Western印迹检测A549细胞TLR3 mRNA和蛋白的表达.根据筛选的结果,选取最有效的载体进行病毒的大量包装.结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果 与预期结果 一致,经包装产生的病毒滴度分别为2×108、2×108、2×108、1×108TU/mL.感染A549细胞后,TLR3基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(均P＜0.05),其中TLR3-RNAi-LV 4# 作用较明显,使mRNA表达下降80%,蛋白表达下降68%(均P＜0.05).4#病毒载体大量包装后其滴度为1×109TU/mL.结论 成功构建针对TLR3基因的4个慢病毒载体TLR3-RNAi-LV,体外感染A549细胞后可有效抑制TLR3基因和蛋白的表达.
目的 觀察慢病毒錶達載體介導的RNA榦擾(RNAi)對人肺腺癌細胞株A549細胞Toll樣受體3( Toll-like receptor 3,TLR3 )錶達的影響,為後續的以TLR3基因為靶點的肺癌研究和治療奠定基礎.方法 應用基因工程技術,篩選齣4條針對TLR3基因的RNAi靶序列,分彆與pCCL-GFP載體連接,構建4箇重組慢病毒錶達載體TLR3-RNAi-LV 1#,TLR3-RNAi-LV 2#,TLR3-RNAi-LV 3#,TLR3-RNAi-LV 4#;將連接產物轉化到DH5α感受態細胞,經PCR篩選暘性剋隆、測序鑒定.將TLR3-RNAi-LV、pHelper 1.0、pHelper 2.0共轉染293T細胞,包裝產生慢病毒顆粒併測定病毒滴度.將包裝產生的4種重組慢病毒分彆感染A549細胞,實時定量PCR和Western印跡檢測A549細胞TLR3 mRNA和蛋白的錶達.根據篩選的結果,選取最有效的載體進行病毒的大量包裝.結果 4箇慢病毒載體PCR和測序結果 與預期結果 一緻,經包裝產生的病毒滴度分彆為2×108、2×108、2×108、1×108TU/mL.感染A549細胞後,TLR3基因mRNA和蛋白的錶達量與未感染慢病毒的細胞組及空載體感染組相比均明顯下降(均P＜0.05),其中TLR3-RNAi-LV 4# 作用較明顯,使mRNA錶達下降80%,蛋白錶達下降68%(均P＜0.05).4#病毒載體大量包裝後其滴度為1×109TU/mL.結論 成功構建針對TLR3基因的4箇慢病毒載體TLR3-RNAi-LV,體外感染A549細胞後可有效抑製TLR3基因和蛋白的錶達.
목적 관찰만병독표체재체개도적RNA간우(RNAi)대인폐선암세포주A549세포Toll양수체3( Toll-like receptor 3,TLR3 )표체적영향,위후속적이TLR3기인위파점적폐암연구화치료전정기출.방법 응용기인공정기술,사선출4조침대TLR3기인적RNAi파서렬,분별여pCCL-GFP재체련접,구건4개중조만병독표체재체TLR3-RNAi-LV 1#,TLR3-RNAi-LV 2#,TLR3-RNAi-LV 3#,TLR3-RNAi-LV 4#;장련접산물전화도DH5α감수태세포,경PCR사선양성극륭、측서감정.장TLR3-RNAi-LV、pHelper 1.0、pHelper 2.0공전염293T세포,포장산생만병독과립병측정병독적도.장포장산생적4충중조만병독분별감염A549세포,실시정량PCR화Western인적검측A549세포TLR3 mRNA화단백적표체.근거사선적결과,선취최유효적재체진행병독적대량포장.결과 4개만병독재체PCR화측서결과 여예기결과 일치,경포장산생적병독적도분별위2×108、2×108、2×108、1×108TU/mL.감염A549세포후,TLR3기인mRNA화단백적표체량여미감염만병독적세포조급공재체감염조상비균명현하강(균P＜0.05),기중TLR3-RNAi-LV 4# 작용교명현,사mRNA표체하강80%,단백표체하강68%(균P＜0.05).4#병독재체대량포장후기적도위1×109TU/mL.결론 성공구건침대TLR3기인적4개만병독재체TLR3-RNAi-LV,체외감염A549세포후가유효억제TLR3기인화단백적표체.
