江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2013年
1期
108-113
,共6页
陈倩%黎敏义%刘颖%施振旦
陳倩%黎敏義%劉穎%施振旦
진천%려민의%류영%시진단
蓝塘猪%抑制素α亚基%成熟肽%克隆%表达
藍塘豬%抑製素α亞基%成熟肽%剋隆%錶達
람당저%억제소α아기%성숙태%극륭%표체
为了克隆猪抑制素α亚基基因和表达其重组蛋白质,本试验采集发情期蓝塘猪卵巢组织,并从中快速抽提总RNA,以此作为模板并根据猪抑制素α亚基基因编码区序列(GenBank号:NM214189)设计合成1对引物,经反转录扩增获得了猪抑制素α亚基基因编码区全长序列.另外,再设计1对特异性引物以扩增抑制素α亚基成熟肽cDNA,并将扩增产物克隆到表达载体pRSET A的％lⅡ和EcoR Ⅰ酶切位点之间,构建重组质粒pINH-SCAU并转化Escherichiα.coli BL21 (DE3)株.转化重组质粒pINH-SCAU的重组菌经IPTG诱导后表达的重组蛋白质分子量为20 000,经Ni-NTA凝胶纯化和兔抗牛抑制素α亚基抗体的特异性免疫反应,证明为抑制素α亚基重组融合蛋白质.对蛋白质表达条件的比较,结果显示重组菌经常规诱导剂0.05 mmol/L IPTG诱导5h后的细菌生长密度OD6∞值为2,抑制素α亚基重组融合蛋白质的最高表达量为总菌体蛋白质量的32.00％.采用自动诱导培养基替代IPTG,在诱导18 h后能使菌液的OD600达13,同时自动诱导的抑制素融合蛋白质表达量占菌体总蛋白质的32.57％.因此利用自动诱导培养基可以获得较佳的抑制素重组整合蛋白质.
為瞭剋隆豬抑製素α亞基基因和錶達其重組蛋白質,本試驗採集髮情期藍塘豬卵巢組織,併從中快速抽提總RNA,以此作為模闆併根據豬抑製素α亞基基因編碼區序列(GenBank號:NM214189)設計閤成1對引物,經反轉錄擴增穫得瞭豬抑製素α亞基基因編碼區全長序列.另外,再設計1對特異性引物以擴增抑製素α亞基成熟肽cDNA,併將擴增產物剋隆到錶達載體pRSET A的％lⅡ和EcoR Ⅰ酶切位點之間,構建重組質粒pINH-SCAU併轉化Escherichiα.coli BL21 (DE3)株.轉化重組質粒pINH-SCAU的重組菌經IPTG誘導後錶達的重組蛋白質分子量為20 000,經Ni-NTA凝膠純化和兔抗牛抑製素α亞基抗體的特異性免疫反應,證明為抑製素α亞基重組融閤蛋白質.對蛋白質錶達條件的比較,結果顯示重組菌經常規誘導劑0.05 mmol/L IPTG誘導5h後的細菌生長密度OD6∞值為2,抑製素α亞基重組融閤蛋白質的最高錶達量為總菌體蛋白質量的32.00％.採用自動誘導培養基替代IPTG,在誘導18 h後能使菌液的OD600達13,同時自動誘導的抑製素融閤蛋白質錶達量佔菌體總蛋白質的32.57％.因此利用自動誘導培養基可以穫得較佳的抑製素重組整閤蛋白質.
위료극륭저억제소α아기기인화표체기중조단백질,본시험채집발정기람당저란소조직,병종중쾌속추제총RNA,이차작위모판병근거저억제소α아기기인편마구서렬(GenBank호:NM214189)설계합성1대인물,경반전록확증획득료저억제소α아기기인편마구전장서렬.령외,재설계1대특이성인물이확증억제소α아기성숙태cDNA,병장확증산물극륭도표체재체pRSET A적％lⅡ화EcoR Ⅰ매절위점지간,구건중조질립pINH-SCAU병전화Escherichiα.coli BL21 (DE3)주.전화중조질립pINH-SCAU적중조균경IPTG유도후표체적중조단백질분자량위20 000,경Ni-NTA응효순화화토항우억제소α아기항체적특이성면역반응,증명위억제소α아기중조융합단백질.대단백질표체조건적비교,결과현시중조균경상규유도제0.05 mmol/L IPTG유도5h후적세균생장밀도OD6∞치위2,억제소α아기중조융합단백질적최고표체량위총균체단백질량적32.00％.채용자동유도배양기체대IPTG,재유도18 h후능사균액적OD600체13,동시자동유도적억제소융합단백질표체량점균체총단백질적32.57％.인차이용자동유도배양기가이획득교가적억제소중조정합단백질.
