南昌大学学报（医学版）
南昌大學學報（醫學版）
남창대학학보（의학판）
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE JIANGXI
2013年
2期
1-5
,共5页
袁小惠%高安健%邬玉兰%刘志刚
袁小惠%高安健%鄔玉蘭%劉誌剛
원소혜%고안건%오옥란%류지강
粉尘螨%Der f5%蛋白表达%纯化%免疫印迹
粉塵螨%Der f5%蛋白錶達%純化%免疫印跡
분진만%Der f5%단백표체%순화%면역인적
目的 克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 根据Der f5 基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR 方法扩增出Der f5 基因片段,PCR 产物克隆入pMD18-T 载体,转化大肠埃希菌 Top10,经PCR和酶切鉴定并测序.将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5 和空质粒pET-32a 同时用限制性内切酶Bam HⅠ与Hind Ⅲ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌 Top10.构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌 BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导表达.用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5 表达产生的组氨酸重组蛋白.结果 构建了重组质粒pMD18-T-Der f5 和pET32a-Der f5.SDS-PAGE 结果表明Der f5 基因在大肠埃希菌 BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE 结果显示单一条带.该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE 结合活性.结论 克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE 结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础.
目的 剋隆錶達粉塵螨第5組變應原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,併鑒定純化蛋白免疫原性.方法 根據Der f5 基因已知序列,設計齣相應的引物,提取粉塵螨總RNA,採用RT-PCR 方法擴增齣Der f5 基因片段,PCR 產物剋隆入pMD18-T 載體,轉化大腸埃希菌 Top10,經PCR和酶切鑒定併測序.將上述所得暘性剋隆菌株擴大培養,堿裂解法提取質粒,所得重組質粒pMD18-T-Der f5 和空質粒pET-32a 同時用限製性內切酶Bam HⅠ與Hind Ⅲ雙酶切,經純化後連接併轉化至大腸埃希菌 Top10.構建的重組質粒pET32a-Der f5,經PCR、酶切和測序鑒定後,再轉化至大腸埃希菌 BL21(DE3),異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 誘導錶達.用十二烷基磺痠鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 和蛋白質印跡法(Western blotting) 鑒定其錶達效果,用Ni+離子親和層析柱純化重組質粒pET32a-Der f5 錶達產生的組氨痠重組蛋白.結果 構建瞭重組質粒pMD18-T-Der f5 和pET32a-Der f5.SDS-PAGE 結果錶明Der f5 基因在大腸埃希菌 BL21(DE3)中穫得良好的錶達,經親和層析純化後,SDS-PAGE 結果顯示單一條帶.該蛋白以塵螨過敏患者血清進行Western blotting,結果錶明具有良好的IgE 結閤活性.結論 剋隆、錶達併純化瞭具有良好塵螨緻敏患者IgE 結閤活性的Der f5,為粉塵螨變態反應性疾病的特異性診斷和治療以及進一步的實驗研究奠定瞭基礎.
목적 극륭표체분진만제5조변응원(dermatophagoides farinae,Der f5)기인,병감정순화단백면역원성.방법 근거Der f5 기인이지서렬,설계출상응적인물,제취분진만총RNA,채용RT-PCR 방법확증출Der f5 기인편단,PCR 산물극륭입pMD18-T 재체,전화대장애희균 Top10,경PCR화매절감정병측서.장상술소득양성극륭균주확대배양,감렬해법제취질립,소득중조질립pMD18-T-Der f5 화공질립pET-32a 동시용한제성내절매Bam HⅠ여Hind Ⅲ쌍매절,경순화후련접병전화지대장애희균 Top10.구건적중조질립pET32a-Der f5,경PCR、매절화측서감정후,재전화지대장애희균 BL21(DE3),이병기-β-D-류대반유당감(IPTG) 유도표체.용십이완기광산납-취병희선알응효전영(SDS-PAGE) 화단백질인적법(Western blotting) 감정기표체효과,용Ni+리자친화층석주순화중조질립pET32a-Der f5 표체산생적조안산중조단백.결과 구건료중조질립pMD18-T-Der f5 화pET32a-Der f5.SDS-PAGE 결과표명Der f5 기인재대장애희균 BL21(DE3)중획득량호적표체,경친화층석순화후,SDS-PAGE 결과현시단일조대.해단백이진만과민환자혈청진행Western blotting,결과표명구유량호적IgE 결합활성.결론 극륭、표체병순화료구유량호진만치민환자IgE 결합활성적Der f5,위분진만변태반응성질병적특이성진단화치료이급진일보적실험연구전정료기출.
