中国实验诊断学
中國實驗診斷學
중국실험진단학
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY DIAGNOSIS
2012年
12期
2190-2193
,共4页
王淑荣%王晨光%齐首楠%苏冠方
王淑榮%王晨光%齊首楠%囌冠方
왕숙영%왕신광%제수남%소관방
视网膜干细胞%荧光蛋白%基因转染
視網膜榦細胞%熒光蛋白%基因轉染
시망막간세포%형광단백%기인전염
目的 观察蛋白质粒转染大鼠视网膜干细胞后蛋白的表达及细胞生长、分化情况.方法 应用机械-酶消化法将出生10 d大鼠的睫状体组织制成单细胞悬液,并应用含20 μg/L表皮生长因子、20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子和1×B27添加剂在无血清DMEM/F12培养基中培养.取第2代细胞应用免疫细胞化学染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)的表达.应用脂质体转染法将含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的质粒pGCsilencerTM U6/Neo/GFP转染到RSCs内,转染后应用荧光显微镜观察细胞生长情况,转染后应用G418筛选,一周后对转染后的细胞应用含50 ml/L的胎牛血清的培养基进行诱导分化,并应用免疫细胞化学染色方法对于分化后的细胞进行神经元标志物神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase,NSE)、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)检测.结果 原代细胞培养2 d后在培养基内可以观察到悬浮的折光性强的小细胞团,4-5 d后细胞团数量增多且体积变大,7-9 d后细胞传代,应用免疫细胞化学方法可检测到细胞表达神经标志物nestin及增殖标志BrdU,基因转染1 d后即可在细胞内观察到荧光的表达,于转染2-3 d后荧光逐渐增强并可维持较长时间.筛选一周时细胞基本均表达GFP.转染后细胞的生长特性未发生明显变化,在以血清为诱导条件下仍可分化出神经样细胞.诱导第7日免疫化学染色分别检测出神经元及胶质细胞标志物NSE及GFAP的表达.结论 来源于睫状区的大鼠视网膜干细胞经基因转染后可在一定时间内稳定表达,并且细胞增殖及分化未受到明显影响,实验为下一步进行RSCs内表达或抑制特定的目的 基因的实验研究奠定了基础.
目的 觀察蛋白質粒轉染大鼠視網膜榦細胞後蛋白的錶達及細胞生長、分化情況.方法 應用機械-酶消化法將齣生10 d大鼠的睫狀體組織製成單細胞懸液,併應用含20 μg/L錶皮生長因子、20 μg/L 堿性成纖維細胞生長因子和1×B27添加劑在無血清DMEM/F12培養基中培養.取第2代細胞應用免疫細胞化學染色檢測神經榦細胞特異性抗原神經巢蛋白(nestin)及細胞分裂增殖標誌物5-溴脫氧尿覈苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)的錶達.應用脂質體轉染法將含有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的質粒pGCsilencerTM U6/Neo/GFP轉染到RSCs內,轉染後應用熒光顯微鏡觀察細胞生長情況,轉染後應用G418篩選,一週後對轉染後的細胞應用含50 ml/L的胎牛血清的培養基進行誘導分化,併應用免疫細胞化學染色方法對于分化後的細胞進行神經元標誌物神經元特異性烯醇酶(neurone specific enolase,NSE)、神經膠質細胞標誌物神經膠質痠性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)檢測.結果 原代細胞培養2 d後在培養基內可以觀察到懸浮的摺光性彊的小細胞糰,4-5 d後細胞糰數量增多且體積變大,7-9 d後細胞傳代,應用免疫細胞化學方法可檢測到細胞錶達神經標誌物nestin及增殖標誌BrdU,基因轉染1 d後即可在細胞內觀察到熒光的錶達,于轉染2-3 d後熒光逐漸增彊併可維持較長時間.篩選一週時細胞基本均錶達GFP.轉染後細胞的生長特性未髮生明顯變化,在以血清為誘導條件下仍可分化齣神經樣細胞.誘導第7日免疫化學染色分彆檢測齣神經元及膠質細胞標誌物NSE及GFAP的錶達.結論 來源于睫狀區的大鼠視網膜榦細胞經基因轉染後可在一定時間內穩定錶達,併且細胞增殖及分化未受到明顯影響,實驗為下一步進行RSCs內錶達或抑製特定的目的 基因的實驗研究奠定瞭基礎.
목적 관찰단백질립전염대서시망막간세포후단백적표체급세포생장、분화정황.방법 응용궤계-매소화법장출생10 d대서적첩상체조직제성단세포현액,병응용함20 μg/L표피생장인자、20 μg/L 감성성섬유세포생장인자화1×B27첨가제재무혈청DMEM/F12배양기중배양.취제2대세포응용면역세포화학염색검측신경간세포특이성항원신경소단백(nestin)급세포분렬증식표지물5-추탈양뇨핵감(5-bromodeoxyuridine,BrdU)적표체.응용지질체전염법장함유록색형광단백(green fluorescent protein,GFP)적질립pGCsilencerTM U6/Neo/GFP전염도RSCs내,전염후응용형광현미경관찰세포생장정황,전염후응용G418사선,일주후대전염후적세포응용함50 ml/L적태우혈청적배양기진행유도분화,병응용면역세포화학염색방법대우분화후적세포진행신경원표지물신경원특이성희순매(neurone specific enolase,NSE)、신경효질세포표지물신경효질산성단백(glial fibrillary acidic protein,GFAP)검측.결과 원대세포배양2 d후재배양기내가이관찰도현부적절광성강적소세포단,4-5 d후세포단수량증다차체적변대,7-9 d후세포전대,응용면역세포화학방법가검측도세포표체신경표지물nestin급증식표지BrdU,기인전염1 d후즉가재세포내관찰도형광적표체,우전염2-3 d후형광축점증강병가유지교장시간.사선일주시세포기본균표체GFP.전염후세포적생장특성미발생명현변화,재이혈청위유도조건하잉가분화출신경양세포.유도제7일면역화학염색분별검측출신경원급효질세포표지물NSE급GFAP적표체.결론 래원우첩상구적대서시망막간세포경기인전염후가재일정시간내은정표체,병차세포증식급분화미수도명현영향,실험위하일보진행RSCs내표체혹억제특정적목적 기인적실험연구전정료기출.
