CAJ | 학술논문

目的筛选心肌细胞内哪些蛋白质与HERG钾通道存在相互作用.方法 (1)通过PCR方法扩增编码心脏herg基因N端的cDNA片段(HERG-NT,aa l-403)和C端的cDNA片段(HERG-CT,aa 669-1159),分别克隆进入pGBKT7载体,构建pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT诱饵质粒；(2)将被诱饵质粒转化的AH109分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/X-α-Gal平板上,以观察诱饵蛋白是否自我激活报告基因；(3)将已被诱饵质粒转化的AH109分别与预转染于Y187的人类心脏cDNA文库进行酵母双杂交,分离阳性克隆中的cDNA,并测序.结果 (1)成功构建诱饵载体pGBKT7-herg-NT和pGBKT7-herg-CT,测序结果表明herg-NT和herg-CT都和“GAL4 DNA-BD-C-Myc”在同一读框,没有PCR引起的突变；(2)“诱饵”蛋白HERG-NT和HERG-CT均未能自我激化报告基因Ade2、Mel1和LacZ,弱激活报告基因His3,应用5mmol/L的3-AT可以有效抑制HERG-NT或HERG-CT所引起的组氨酸表达；(4)经过严格筛选后,发现Caveolin-1、FHL2和PTPN12等15种蛋白与HERG-NT存在相互作用,Myotrophin等8种蛋白与HERG-CT相互作用.结论成功应用酵母双杂交技术,以HERG钾通道蛋白的氨基端或羧基端为诱饵蛋白,筛选HERG钾通道的相互作用蛋白(Caveolin-1、FHL2、PTPN12,Myotrophin等),这些蛋白质可能与HERG存在相互作用.
목적 사선심기세포내나사단백질여HERG갑통도존재상호작용.방법 (1)통과PCR방법확증편마심장herg기인N단적cDNA편단(HERG-NT,aa l-403)화C단적cDNA편단(HERG-CT,aa 669-1159),분별극륭진입pGBKT7재체,구건pGBKT7-herg-NT화pGBKT7-herg-CT유이질립；(2)장피유이질립전화적AH109분별도포우SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade화SD/-Trp/X-α-Gal평판상,이관찰유이단백시부자아격활보고기인；(3)장이피유이질립전화적AH109분별여예전염우Y187적인류심장cDNA문고진행효모쌍잡교,분리양성극륭중적cDNA,병측서.결과 (1)성공구건유이재체pGBKT7-herg-NT화pGBKT7-herg-CT,측서결과표명herg-NT화herg-CT도화“GAL4 DNA-BD-C-Myc”재동일독광,몰유PCR인기적돌변；(2)“유이”단백HERG-NT화HERG-CT균미능자아격화보고기인Ade2、Mel1화LacZ,약격활보고기인His3,응용5mmol/L적3-AT가이유효억제HERG-NT혹HERG-CT소인기적조안산표체；(4)경과엄격사선후,발현Caveolin-1、FHL2화PTPN12등15충단백여HERG-NT존재상호작용,Myotrophin등8충단백여HERG-CT상호작용.결론 성공응용효모쌍잡교기술,이HERG갑통도단백적안기단혹최기단위유이단백,사선HERG갑통도적상호작용단백(Caveolin-1、FHL2、PTPN12,Myotrophin등),저사단백질가능여HERG존재상호작용.