CAJ | 학술논문

为建立一种用SYBR Green Ⅰ荧光染料检测PK-15细胞α干扰素(α-IFN)效应因子Mx1、OAS的mRNA表达水平的qPCR检测方法,通过在猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)抑制α-IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用.根据GenBank中目的基因的序列,利用分子生物学软件Premier 5.0在其保守区设计并合成相应的特异性引物.利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T) 15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH 5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR Green I qPCR标准曲线和溶解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验.根据建立的实时qPCR方法,检测PCV2对α-IFN效应因子的抑制效果.对建立的PK-15细胞α-IFN效应因子SYBR Green I qPCR方法进行分析,结果表明Mx1、OAS和内参β-actin基因的Ct值与标准品稀释度在1×10(1)～1×10(8) copies/μL的范围分别呈良好的线性关系.PK-15细胞在接种PCV2,并受到α-IFN刺激后Mx1、OAS的相对表达量较未接种PCV2明显降低.本试验建立了PK-15细胞α-IFN效应因子的qPCR检测方法,为在mRNA水平上对PK-15细胞α-IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于PCV2抑制α-IFN发挥效应的信号通路研究中.
위건립일충용SYBR Green Ⅰ형광염료검측PK-15세포α간우소(α-IFN)효응인자Mx1、OAS적mRNA표체수평적qPCR검측방법,통과재저원배병독2형(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)억제α-IFN발휘효응적신호통로중진행초보응용.근거GenBank중목적기인적서렬,이용분자생물학연건Premier 5.0재기보수구설계병합성상응적특이성인물.이용TRIzol법제취총RNA,경Oligo d(T) 15진행반전록,이용PCR확증각단목적기인,병극륭지pMD 18-T재체,전화대장간균DH 5α,경감정위양성적중조질립작위표준품모판건립SYBR Green I qPCR표준곡선화용해곡선,병진행령민성、특이성화중복성시험.근거건립적실시qPCR방법,검측PCV2대α-IFN효응인자적억제효과.대건립적PK-15세포α-IFN효응인자SYBR Green I qPCR방법진행분석,결과표명Mx1、OAS화내삼β-actin기인적Ct치여표준품희석도재1×10(1)～1×10(8) copies/μL적범위분별정량호적선성관계.PK-15세포재접충PCV2,병수도α-IFN자격후Mx1、OAS적상대표체량교미접충PCV2명현강저.본시험건립료PK-15세포α-IFN효응인자적qPCR검측방법,위재mRNA수평상대PK-15세포α-IFN효응인자적정량분석전정료기출,병성공지초보응용우PCV2억제α-IFN발휘효응적신호통로연구중.