重庆医学
重慶醫學
중경의학
CHONGQING MEDICAL JOURNAL
2013年
13期
1499-1501,1505
,共4页
DNA聚合酶Ⅲ%真核载体%细胞
DNA聚閤酶Ⅲ%真覈載體%細胞
DNA취합매Ⅲ%진핵재체%세포
目的 构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平.方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2 cDNA片段,与pMD18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2；将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2.应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照；用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2 mRNA及蛋白表达水平.结果 正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2 cDNA序列完全一致.RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2 mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组；Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性.结论 人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功.
目的 構建人DNA聚閤酶δ2(DNA Polδ2)真覈錶達載體,轉染人胚胎腎細胞(HEK293)併觀察其錶達水平.方法用逆轉錄PCR(RT-PCR)方法從人胚肺成纖維細胞(WI38細胞)擴增目的基因DNA Polδ2 cDNA片段,與pMD18T載體連接,構建質粒pMD-18T-Polδ2；將目的片段DNA Polδ2從質粒pMD-18T-Polδ2切下,與真覈錶達載體pcDNA 3.1(+)連接,構建正義及反義真覈錶達載體pcDNA 3.1-Polδ2.應用脂質體轉染試劑,分彆將正義、反義真錶達載體pcDNA 3.1-Polδ2,空載體pcDNA3.1(+)轉染至HEK293細胞,同時設置陰性對照；用RT-PCR和Western blot方法檢測目的基因DNA Polδ2 mRNA及蛋白錶達水平.結果 正義和反義DNA Polδ2真覈錶達載體pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段與GENEBANK上DNA Polδ2 cDNA序列完全一緻.RT-PCR方法顯示正義及反義真覈錶達載體轉染組細胞的目的基因DNA Polδ2 mRNA錶達均明顯高于空載體轉染組及陰性對照組；Western blot顯示正義真覈錶達載體轉染組細胞DNA Polδ2蛋白錶達明顯增彊,反義真覈錶達載體轉染組細胞DNA Polδ2蛋白錶達陰性.結論 人DNA Polδ2正義及反義真覈錶達載體pcDNA3.1-Polδ2構建成功.
목적 구건인DNA취합매δ2(DNA Polδ2)진핵표체재체,전염인배태신세포(HEK293)병관찰기표체수평.방법용역전록PCR(RT-PCR)방법종인배폐성섬유세포(WI38세포)확증목적기인DNA Polδ2 cDNA편단,여pMD18T재체련접,구건질립pMD-18T-Polδ2；장목적편단DNA Polδ2종질립pMD-18T-Polδ2절하,여진핵표체재체pcDNA 3.1(+)련접,구건정의급반의진핵표체재체pcDNA 3.1-Polδ2.응용지질체전염시제,분별장정의、반의진표체재체pcDNA 3.1-Polδ2,공재체pcDNA3.1(+)전염지HEK293세포,동시설치음성대조；용RT-PCR화Western blot방법검측목적기인DNA Polδ2 mRNA급단백표체수평.결과 정의화반의DNA Polδ2진핵표체재체pcDNA3.1-Polδ2중삽입적목적편단여GENEBANK상DNA Polδ2 cDNA서렬완전일치.RT-PCR방법현시정의급반의진핵표체재체전염조세포적목적기인DNA Polδ2 mRNA표체균명현고우공재체전염조급음성대조조；Western blot현시정의진핵표체재체전염조세포DNA Polδ2단백표체명현증강,반의진핵표체재체전염조세포DNA Polδ2단백표체음성.결론 인DNA Polδ2정의급반의진핵표체재체pcDNA3.1-Polδ2구건성공.
