天津医科大学学报
天津醫科大學學報
천진의과대학학보
JOURNAL OF TIANJIN MEDICAL UNIVERSITY
2013年
3期
169-173,259
,共6页
人类P100蛋白%慢病毒载体%质粒%白血病%RNA干扰
人類P100蛋白%慢病毒載體%質粒%白血病%RNA榦擾
인류P100단백%만병독재체%질립%백혈병%RNA간우
目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系.方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒.将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒.收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平.结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90％以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础.
目的:分彆構建人類P100蛋白過錶達和降錶達慢病毒載體併建立其過錶達(NB4-pCDH-p100)和降錶達(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病細胞繫.方法:對于人類P100蛋白過錶達慢病毒質粒構建,利用Eco RI和BamHI限製性內切酶對已構建好的質粒pEGFP-C2-p100進行雙酶切以穫得p100基因片段,迴收純化後連接到慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;對于人類P100蛋白降錶達慢病毒質粒構建,設計針對人類p100基因的siRNA序列,進一步閤成靶序列的Oligo DNA併構建pLKO.3G-shp100質粒.將構建好的P100蛋白過錶達和降錶達質粒與慢病毒包裝質粒共轉染293T細胞,包裝產生假病毒顆粒.收集濃縮假病毒顆粒感染NB4細胞,併篩選單剋隆細胞株.熒光顯微鏡下觀察感染效率,利用Western blot方法檢測細胞株中P100蛋白的錶達水平.結果:通過對重組質粒進行酶切鑒定,觀察到插入的人類p100片段和其榦擾片段,併穫得瞭P100蛋白過錶達和降錶達NB4細胞株,熒光顯微鏡下檢測到感染效率達90％以上,Western blot方法證實NB4-pCDH-p100細胞株中P100蛋白錶達水平明顯增高,NB4-pLKO-shp100細胞株中P100蛋白錶達水平明顯降低.結論:成功構建瞭人類P100蛋白過錶達和降錶達慢病毒質粒併建立其過錶達和降錶達白血病細胞株,可為有關人類P100蛋白功能及作用機製研究奠定基礎.
목적:분별구건인류P100단백과표체화강표체만병독재체병건립기과표체(NB4-pCDH-p100)화강표체(NB4-pLKO-shp100)적NB4인백혈병세포계.방법:대우인류P100단백과표체만병독질립구건,이용Eco RI화BamHI한제성내절매대이구건호적질립pEGFP-C2-p100진행쌍매절이획득p100기인편단,회수순화후련접도만병독재체pCDH1-MCS1-EF1-copGFP상;대우인류P100단백강표체만병독질립구건,설계침대인류p100기인적siRNA서렬,진일보합성파서렬적Oligo DNA병구건pLKO.3G-shp100질립.장구건호적P100단백과표체화강표체질립여만병독포장질립공전염293T세포,포장산생가병독과립.수집농축가병독과립감염NB4세포,병사선단극륭세포주.형광현미경하관찰감염효솔,이용Western blot방법검측세포주중P100단백적표체수평.결과:통과대중조질립진행매절감정,관찰도삽입적인류p100편단화기간우편단,병획득료P100단백과표체화강표체NB4세포주,형광현미경하검측도감염효솔체90％이상,Western blot방법증실NB4-pCDH-p100세포주중P100단백표체수평명현증고,NB4-pLKO-shp100세포주중P100단백표체수평명현강저.결론:성공구건료인류P100단백과표체화강표체만병독질립병건립기과표체화강표체백혈병세포주,가위유관인류P100단백공능급작용궤제연구전정기출.
