CAJ | 학술논문

目的:构建miR-494基因的慢病毒表达载体.方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增hsa-miR -494基因,用Xho Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切携带EGFP的慢病毒载体pGIPZ,酶切产物电泳后回收约11kb的载体片段.使用DNA连接试剂盒中的Solution Ⅰ将其与miR-494连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR-494测序,所构建载体命名为pGIPZ-miR-494-eGFP,获pGIPZ-miR-494-eGFP后按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产.将慢病毒颗粒以最适滴度感染人体肺腺癌细胞株A549,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用Real-Time PCR检测感染效率.结果:目的基因与慢病毒载体连接成功.共转染293T细胞包装病毒与浓缩后滴度达1.02×108TU/ml,并转染到肺腺癌细胞株A549上,Aldefluor流式分选出的细胞后通过Real-Time PCR检测结果显示miR-494慢病毒表达载体感染的A549细胞miR-494表达高于对照组达10倍以上.结论:成功构建携带人miR-494基因的慢病毒表达载体pGIPZ-miR-494-eGFP,为相关后续研究打下了良好基础.
목적:구건miR-494기인적만병독표체재체.방법:이인기인조DNA위모판,PCR확증hsa-miR -494기인,용Xho Ⅰ、BamH Ⅰ쌍매절휴대EGFP적만병독재체pGIPZ,매절산물전영후회수약11kb적재체편단.사용DNA련접시제합중적Solution Ⅰ장기여miR-494련접,련접산물전화,차일도선단균락,PCR사선정향양성극륭,수후장선정적함유양성극륭적단균락요균,제취질립병행매절감정급대삽입적miR-494측서,소구건재체명명위pGIPZ-miR-494-eGFP,획pGIPZ-miR-494-eGFP후안Invitrogen공사추천적표준정서진행만병독포장화학인만병독시부성공생산.장만병독과립이최괄적도감염인체폐선암세포주A549,통과Aldefluor류식분선출대유목적기인화공재병독적세포,용Real-Time PCR검측감염효솔.결과:목적기인여만병독재체련접성공.공전염293T세포포장병독여농축후적도체1.02×108TU/ml,병전염도폐선암세포주A549상,Aldefluor류식분선출적세포후통과Real-Time PCR검측결과현시miR-494만병독표체재체감염적A549세포miR-494표체고우대조조체10배이상.결론:성공구건휴대인miR-494기인적만병독표체재체pGIPZ-miR-494-eGFP,위상관후속연구타하료량호기출.