医学研究杂志
醫學研究雜誌
의학연구잡지
JOURNAL OF MEDICAL RESEARCH
2013年
2期
23-26
,共4页
王双虎%戴大鹏%胡利明%耿培武%蔡剑平%胡国新
王雙虎%戴大鵬%鬍利明%耿培武%蔡劍平%鬍國新
왕쌍호%대대붕%호리명%경배무%채검평%호국신
CYP2C9%Western blot%体外活性分析
CYP2C9%Western blot%體外活性分析
CYP2C9%Western blot%체외활성분석
目的 建立一种基于COS-7细胞的细胞色素P450 2C9(CYP2C9)体外酶学活性检测的新方法.方法 以野生型CYP2C9*1基因的全长cDNA为模板,通过定点诱变方法获得突变型CYP2C9*2、*3及*13的cDNA全长,分别与分泌型荧光素酶Gluc内参基因一起导人pIRES载体的A、B多克隆位点,构建成双表达载体pIRES-Gluc-CYP2C9.利用Lipofectamine 2000瞬时转染COS-7细胞,48h后弃培养基,加入含100μmol/L Luciferin-H荧光底物的新鲜培养基,继续培养8h后利用Promega CYP2C9活性试剂盒及NEB Gluc检测试剂盒分别检测CYP2C9各型及内参Gluc的活性,用Western blot检测两种蛋白的表达量.结果 本研究成功构建了pIRES-Gluc-CYP2C9*1及其突变体*2、*3、*13的表达载体,通过检测CYP2C9特异性荧光素底物Luciferin-H的分解产物的荧光信号与分泌型荧光素酶Gluc的内参荧光信号的比值作为CYP2C9的体外酶学活性值,研究结果显示突变体CYP2C9 *2、*3、*13的体外酶学活性分别为野生型CYP2C9*1的43.12％、8.15％和1.49％.结论 本研究成功建立了一种基于COS-7细胞的CYP2C9体外酶学活性检测的新方法,该方法操作简便、实验周期短,适于新突变体CYP2C9的快速活性检测及其代谢新药物或抑制剂的相关性研究.
目的 建立一種基于COS-7細胞的細胞色素P450 2C9(CYP2C9)體外酶學活性檢測的新方法.方法 以野生型CYP2C9*1基因的全長cDNA為模闆,通過定點誘變方法穫得突變型CYP2C9*2、*3及*13的cDNA全長,分彆與分泌型熒光素酶Gluc內參基因一起導人pIRES載體的A、B多剋隆位點,構建成雙錶達載體pIRES-Gluc-CYP2C9.利用Lipofectamine 2000瞬時轉染COS-7細胞,48h後棄培養基,加入含100μmol/L Luciferin-H熒光底物的新鮮培養基,繼續培養8h後利用Promega CYP2C9活性試劑盒及NEB Gluc檢測試劑盒分彆檢測CYP2C9各型及內參Gluc的活性,用Western blot檢測兩種蛋白的錶達量.結果 本研究成功構建瞭pIRES-Gluc-CYP2C9*1及其突變體*2、*3、*13的錶達載體,通過檢測CYP2C9特異性熒光素底物Luciferin-H的分解產物的熒光信號與分泌型熒光素酶Gluc的內參熒光信號的比值作為CYP2C9的體外酶學活性值,研究結果顯示突變體CYP2C9 *2、*3、*13的體外酶學活性分彆為野生型CYP2C9*1的43.12％、8.15％和1.49％.結論 本研究成功建立瞭一種基于COS-7細胞的CYP2C9體外酶學活性檢測的新方法,該方法操作簡便、實驗週期短,適于新突變體CYP2C9的快速活性檢測及其代謝新藥物或抑製劑的相關性研究.
목적 건립일충기우COS-7세포적세포색소P450 2C9(CYP2C9)체외매학활성검측적신방법.방법 이야생형CYP2C9*1기인적전장cDNA위모판,통과정점유변방법획득돌변형CYP2C9*2、*3급*13적cDNA전장,분별여분비형형광소매Gluc내삼기인일기도인pIRES재체적A、B다극륭위점,구건성쌍표체재체pIRES-Gluc-CYP2C9.이용Lipofectamine 2000순시전염COS-7세포,48h후기배양기,가입함100μmol/L Luciferin-H형광저물적신선배양기,계속배양8h후이용Promega CYP2C9활성시제합급NEB Gluc검측시제합분별검측CYP2C9각형급내삼Gluc적활성,용Western blot검측량충단백적표체량.결과 본연구성공구건료pIRES-Gluc-CYP2C9*1급기돌변체*2、*3、*13적표체재체,통과검측CYP2C9특이성형광소저물Luciferin-H적분해산물적형광신호여분비형형광소매Gluc적내삼형광신호적비치작위CYP2C9적체외매학활성치,연구결과현시돌변체CYP2C9 *2、*3、*13적체외매학활성분별위야생형CYP2C9*1적43.12％、8.15％화1.49％.결론 본연구성공건립료일충기우COS-7세포적CYP2C9체외매학활성검측적신방법,해방법조작간편、실험주기단,괄우신돌변체CYP2C9적쾌속활성검측급기대사신약물혹억제제적상관성연구.
