中国畜牧杂志
中國畜牧雜誌
중국축목잡지
CHINESE JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE
2013年
3期
64-68
,共5页
裴红蕾%陈轶群%吕俊楠%杨雯涵%李志民%曹云鹤
裴紅蕾%陳軼群%呂俊楠%楊雯涵%李誌民%曹雲鶴
배홍뢰%진질군%려준남%양문함%리지민%조운학
β-1,3-1,4葡聚糖酶%双拷贝%毕赤酵母%发酵
β-1,3-1,4葡聚糖酶%雙拷貝%畢赤酵母%髮酵
β-1,3-1,4포취당매%쌍고패%필적효모%발효
本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵.首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt.该重组质粒经SacⅠ线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不合组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt.制备GS115/9K-glu-opt 感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt.双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍；蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍.
本試驗旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶雙拷貝基因畢赤酵母工程菌株的構建及髮酵.首先,通過對質粒pGAP-glu-opt進行PCR擴增穫得密碼子優化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切後與畢赤酵母錶達載體pPIC9K連接,穫得重組質粒p9K-glu-opt.該重組質粒經SacⅠ線性化後轉化畢赤酵母GS115菌株,利用不閤組氨痠的MDS平闆和搖瓶培養,篩選重組菌株,命名為GS115/9K-glu-opt.製備GS115/9K-glu-opt 感受態細胞,再用線性化的重組質粒pPIC-glu-opt二次轉化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平闆上篩選glu-opt基因雙拷貝重組菌株GS115/2xglu-opt.雙拷貝重組菌在10 L髮酵罐中進行高密度髮酵培養及甲醇誘導錶達,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活達到21 600 U/mL,約為單拷貝工程菌株X33/pPIC-glu-opt髮酵活力的1.44倍；蛋白錶達量達8.4 g/L,約為X33/pPIC-glu-opt的1.68倍.
본시험지재연구β-1,3-1,4포취당매쌍고패기인필적효모공정균주적구건급발효.수선,통과대질립pGAP-glu-opt진행PCR확증획득밀마자우화적β-1,3-1,4포취당매기인glu-opt,용EcoR Ⅰ화Not Ⅰ쌍매절후여필적효모표체재체pPIC9K련접,획득중조질립p9K-glu-opt.해중조질립경SacⅠ선성화후전화필적효모GS115균주,이용불합조안산적MDS평판화요병배양,사선중조균주,명명위GS115/9K-glu-opt.제비GS115/9K-glu-opt 감수태세포,재용선성화적중조질립pPIC-glu-opt이차전화,재함유항생소Zeocin적YPDS평판상사선glu-opt기인쌍고패중조균주GS115/2xglu-opt.쌍고패중조균재10 L발효관중진행고밀도발효배양급갑순유도표체,β-1,3-1,4포취당매최고매활체도21 600 U/mL,약위단고패공정균주X33/pPIC-glu-opt발효활력적1.44배；단백표체량체8.4 g/L,약위X33/pPIC-glu-opt적1.68배.
