重庆医学
重慶醫學
중경의학
CHONGQING MEDICAL JOURNAL
2013年
16期
1837-1840
,共4页
李锋%罗文军%唐博%陈以宽%孙建明%付健
李鋒%囉文軍%唐博%陳以寬%孫建明%付健
리봉%라문군%당박%진이관%손건명%부건
血小板衍生生长因子C%pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体%内皮祖细胞%转染
血小闆衍生生長因子C%pAD/CMV/V5-DEST腺病毒載體%內皮祖細胞%轉染
혈소판연생생장인자C%pAD/CMV/V5-DEST선병독재체%내피조세포%전염
目的 构建含大鼠血小板衍生生长因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重组腺病毒表达载体,体外转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)并观察目的基因蛋白及mRNA表达情况.方法 通过逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)法从pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表达载体中获得PDGF-C目的片段,经BP重组与LR重组插入到pAD/CMV/V5-DEST,构建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒载体.酶切及DNA测序鉴定后转染HEK293A包装、纯化,测定病毒滴度后转染大鼠骨髓源性EPCs,应用Real-time qPCR、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测PDGF-C蛋白及mRNA的表达.结果 核酸内切酶消化及PCR分析证实PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体,转染后荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,转染48 h后实时定量酵素聚合反应技术(Real-time qPCR)测定EPCs中PDGF-C含量明显提高(P＜0.05),Wester blotting检测证实在46×103存在特异性条带.结论 成功构建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表达载体pAD-EGFP-PDGF-C,体外转染大鼠骨髓源性EPCs能高效表达目的基因产物,为后续研究PDGF-C基因功能以及进一步开展基因治疗奠定了基础.
目的 構建含大鼠血小闆衍生生長因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重組腺病毒錶達載體,體外轉染骨髓源性內皮祖細胞(EPCs)併觀察目的基因蛋白及mRNA錶達情況.方法 通過逆轉錄聚閤酶鏈式反應技術(RT-PCR)法從pIRES2-EGFP-PDGF-C真覈錶達載體中穫得PDGF-C目的片段,經BP重組與LR重組插入到pAD/CMV/V5-DEST,構建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒載體.酶切及DNA測序鑒定後轉染HEK293A包裝、純化,測定病毒滴度後轉染大鼠骨髓源性EPCs,應用Real-time qPCR、蛋白免疫印跡法(Western blotting)等方法檢測PDGF-C蛋白及mRNA的錶達.結果 覈痠內切酶消化及PCR分析證實PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒載體,轉染後熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白錶達,轉染48 h後實時定量酵素聚閤反應技術(Real-time qPCR)測定EPCs中PDGF-C含量明顯提高(P＜0.05),Wester blotting檢測證實在46×103存在特異性條帶.結論 成功構建瞭大鼠PDGF-C基因的腺病毒錶達載體pAD-EGFP-PDGF-C,體外轉染大鼠骨髓源性EPCs能高效錶達目的基因產物,為後續研究PDGF-C基因功能以及進一步開展基因治療奠定瞭基礎.
목적 구건함대서혈소판연생생장인자C(PDGF-C)기인적pAD-EGFP-PDGF-C적중조선병독표체재체,체외전염골수원성내피조세포(EPCs)병관찰목적기인단백급mRNA표체정황.방법 통과역전록취합매련식반응기술(RT-PCR)법종pIRES2-EGFP-PDGF-C진핵표체재체중획득PDGF-C목적편단,경BP중조여LR중조삽입도pAD/CMV/V5-DEST,구건pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP선병독재체.매절급DNA측서감정후전염HEK293A포장、순화,측정병독적도후전염대서골수원성EPCs,응용Real-time qPCR、단백면역인적법(Western blotting)등방법검측PDGF-C단백급mRNA적표체.결과 핵산내절매소화급PCR분석증실PDGF-C기인성공삽입pAD/CMV/V5-DEST선병독재체,전염후형광현미경하관찰가견록색형광단백표체,전염48 h후실시정량효소취합반응기술(Real-time qPCR)측정EPCs중PDGF-C함량명현제고(P＜0.05),Wester blotting검측증실재46×103존재특이성조대.결론 성공구건료대서PDGF-C기인적선병독표체재체pAD-EGFP-PDGF-C,체외전염대서골수원성EPCs능고효표체목적기인산물,위후속연구PDGF-C기인공능이급진일보개전기인치료전정료기출.
