医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2013年
2期
63-68
,共6页
attB位点%点突变%大引物%整合率
attB位點%點突變%大引物%整閤率
attB위점%점돌변%대인물%정합솔
目的 考察attB位点核心区碱基突变对ΦC31整合酶在真核细胞中催化目的基因整合效率的影响.方法 选取attB位点核心区中可能对ΦC31整合酶效率产生影响的碱基,设计含有相应位点突变的引物,采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB片段,将其连入含报告基因的载体pEGFP-N1中得到pEGFP-N1-attBm.以含野生型attB位点的报告基因载体pEGFP-N1-attB作为对照,将上述载体分别与ΦC31整合酶表达质粒共转染HeLa细胞,经过药物筛选、染色、细胞克隆计数后,计算并比较整合效率.结果 成功完成9个含有突变碱基attB位点及报告基因载体的构建.酶切及测序鉴定结果显示每个质粒含1或2个突变碱基.其中6个质粒为目标碱基突变,3个为PCR过程中随机产生的非预期突变.细胞实验结果表明,3个含有突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比无显著性差异,其余6个突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比显著降低(P<0.05),尤其是其中两个attB位点中含有2个碱基突变的报告质粒,整合率降低极为显著(P<0.001).结论 attB位点核心区碱基保守性较强,其中一些关键位点的突变使得整合酶效率降低.
目的 攷察attB位點覈心區堿基突變對ΦC31整閤酶在真覈細胞中催化目的基因整閤效率的影響.方法 選取attB位點覈心區中可能對ΦC31整閤酶效率產生影響的堿基,設計含有相應位點突變的引物,採用大引物法兩輪PCR擴增得到含突變堿基的attB片段,將其連入含報告基因的載體pEGFP-N1中得到pEGFP-N1-attBm.以含野生型attB位點的報告基因載體pEGFP-N1-attB作為對照,將上述載體分彆與ΦC31整閤酶錶達質粒共轉染HeLa細胞,經過藥物篩選、染色、細胞剋隆計數後,計算併比較整閤效率.結果 成功完成9箇含有突變堿基attB位點及報告基因載體的構建.酶切及測序鑒定結果顯示每箇質粒含1或2箇突變堿基.其中6箇質粒為目標堿基突變,3箇為PCR過程中隨機產生的非預期突變.細胞實驗結果錶明,3箇含有突變attB報告質粒的整閤率與野生型attB相比無顯著性差異,其餘6箇突變attB報告質粒的整閤率與野生型attB相比顯著降低(P<0.05),尤其是其中兩箇attB位點中含有2箇堿基突變的報告質粒,整閤率降低極為顯著(P<0.001).結論 attB位點覈心區堿基保守性較彊,其中一些關鍵位點的突變使得整閤酶效率降低.
목적 고찰attB위점핵심구감기돌변대ΦC31정합매재진핵세포중최화목적기인정합효솔적영향.방법 선취attB위점핵심구중가능대ΦC31정합매효솔산생영향적감기,설계함유상응위점돌변적인물,채용대인물법량륜PCR확증득도함돌변감기적attB편단,장기련입함보고기인적재체pEGFP-N1중득도pEGFP-N1-attBm.이함야생형attB위점적보고기인재체pEGFP-N1-attB작위대조,장상술재체분별여ΦC31정합매표체질립공전염HeLa세포,경과약물사선、염색、세포극륭계수후,계산병비교정합효솔.결과 성공완성9개함유돌변감기attB위점급보고기인재체적구건.매절급측서감정결과현시매개질립함1혹2개돌변감기.기중6개질립위목표감기돌변,3개위PCR과정중수궤산생적비예기돌변.세포실험결과표명,3개함유돌변attB보고질립적정합솔여야생형attB상비무현저성차이,기여6개돌변attB보고질립적정합솔여야생형attB상비현저강저(P<0.05),우기시기중량개attB위점중함유2개감기돌변적보고질립,정합솔강저겁위현저(P<0.001).결론 attB위점핵심구감기보수성교강,기중일사관건위점적돌변사득정합매효솔강저.
