CAJ | 학술논문

目的:克隆小鼠孤儿核受体(NR4A1)基因全长cDNA的读码框,构建携带NR4A1基因的重组真核表达载体,为研究其在心肌细胞中的功能做准备.方法:从Pax-8敲除的小鼠心肌组织中提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,利用逆转录PCR法扩增,将目的产物与pGEM-T Easy载体连接,测序分析正确后,再以相同PCR方法扩增,将其与真核表达载体pIERS2-ZsGreenl连接,构建重组质粒.经限制性酶切及测序鉴定后,利用Lipofectamine2000将重组载体pIERS2-ZsGreenl-NR4A1转染到H9C2心肌细胞.实验分三组:①实验组(PZ-NR4A1组):细胞转染1.2 μg pIERS2-ZsGreenl-NR4A1重组载体；②阴性对照组(NC组):细胞转染1.2 μg pIERS2-ZsGreenl空载体；③空白对照组(BC组):给予的常规培养液,未做其他处理.并用RT-PCR法和Western blotting法检测转染后NR4A1 mRNA和蛋白的表达.结果:成功构建了小鼠pIERS2-ZsGreen1-NR4A1真核表达载体.转染重组载体到细胞后,相比BC组(1.00±0.00)和NC组(0.99±0.16),PZ-NR4A1组(2.62±0.21) NR4A1 mRNA表达水平明显升高(P＜ 0.05),而BC组和NC组mRNA表达水平差异无统计学意义(P＞ 0.05).PZ-NR4A1组(0.72±0.11)NR4A1蛋白的表达量与BC组(0.17±0.07)和NC组(0.21±0.08)相比,PZ-NR4A1组蛋白表达量明显升高(P＜0.05),而BC组和NC组蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:通过基因重组技术,成功克隆了NR4A1基因,并构建了真核表达载体pIERS2-ZsGreenl-NR4A1,且能够在H9C2心肌细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨NR4A1基因的生物学功能及机制奠定了基础.
목적:극륭소서고인핵수체(NR4A1)기인전장cDNA적독마광,구건휴대NR4A1기인적중조진핵표체재체,위연구기재심기세포중적공능주준비.방법:종Pax-8고제적소서심기조직중제취총RNA,통과역전록득도총cDNA,이용역전록PCR법확증,장목적산물여pGEM-T Easy재체련접,측서분석정학후,재이상동PCR방법확증,장기여진핵표체재체pIERS2-ZsGreenl련접,구건중조질립.경한제성매절급측서감정후,이용Lipofectamine2000장중조재체pIERS2-ZsGreenl-NR4A1전염도H9C2심기세포.실험분삼조:①실험조(PZ-NR4A1조):세포전염1.2 μg pIERS2-ZsGreenl-NR4A1중조재체；②음성대조조(NC조):세포전염1.2 μg pIERS2-ZsGreenl공재체；③공백대조조(BC조):급여적상규배양액,미주기타처리.병용RT-PCR법화Western blotting법검측전염후NR4A1 mRNA화단백적표체.결과:성공구건료소서pIERS2-ZsGreen1-NR4A1진핵표체재체.전염중조재체도세포후,상비BC조(1.00±0.00)화NC조(0.99±0.16),PZ-NR4A1조(2.62±0.21) NR4A1 mRNA표체수평명현승고(P＜ 0.05),이BC조화NC조mRNA표체수평차이무통계학의의(P＞ 0.05).PZ-NR4A1조(0.72±0.11)NR4A1단백적표체량여BC조(0.17±0.07)화NC조(0.21±0.08)상비,PZ-NR4A1조단백표체량명현승고(P＜0.05),이BC조화NC조단백표체량차이무통계학의의(P＞0.05).결론:통과기인중조기술,성공극륭료NR4A1기인,병구건료진핵표체재체pIERS2-ZsGreenl-NR4A1,차능구재H9C2심기세포중획득유효과표체,저위진일보탐토NR4A1기인적생물학공능급궤제전정료기출.