CAJ | 학술논문

目的构建含有登革Ⅱ型病毒(DENV-2)前膜蛋白(prM)基因反向重复序列(irRNA)的重组质粒,评价其抑制病毒复制的效果.方法 DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoR Ⅰ的识别位点,将经RT-PCR扩增的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引入酶切位点Nhe Ⅰ和BglⅡ,经RT-PCR扩增prM全长基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重组质粒pMD 18-T-prM.限制性内切酶Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA.筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果.结果成功构建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA.经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28％；实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组(P＜0.05).结论 DENV-2 prM反向重复序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据.
목적 구건함유등혁Ⅱ형병독(DENV-2)전막단백(prM)기인반향중복서렬(irRNA)적중조질립,평개기억제병독복제적효과.방법 DENV-2접충유서,제취총RNA,재정의화반의인물량단분별가상XhoⅠ화EcoR Ⅰ적식별위점,장경RT-PCR확증적prM전장기인편단삽입pcDNA3.1(+)중,형성함유prM반향서렬적중조질립pcDNA-asprM;우령일대정의화반의인물량단인입매절위점Nhe Ⅰ화BglⅡ,경RT-PCR확증prM전장기인편단삽입pMD18-T-vector중,형성함유정향서렬적중조질립pMD 18-T-prM.한제성내절매Nhe Ⅰ화Kpn Ⅰ분별매절중조질립pMD18-T-prM화중조질립pcDNA-asprM,득도편단prM화선성화재체pcDNA-asprM,련접구건성함유prM반향중복서렬적중조질립pcDNA-irRNA.사선적양성중조질립pcDNA-irRNA용지질체법전염지BHK-21세포중,반정량PCR화실시형광정량PCR분석평고해질립억제등혁병독복제적효과.결과 성공구건구유prM반향중복서렬적중조질립pcDNA-irRNA.경전염pcDNA-irRNA적실험조여미전염질립양성대조조상비,반정량PCR결과현시DENV-2공격96 h후NS3적mRNA표체수평하강28％；실시정량PCR분석현시,DENV-2공격72 h후실험조병독고패수비양성대조조소1.44배,공격96 h후실험조적NS1표체량명현저우양성대조조(P＜0.05).결론 DENV-2 prM반향중복서렬구유간우병독복제적효과,위등혁병독기인역묘적연구제공이론의거.