畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2013年
4期
528-534
,共7页
毛志福%王立民%张银国%周平
毛誌福%王立民%張銀國%週平
모지복%왕립민%장은국%주평
人泛素启动子UbB%Fat-1%表达载体%绵羊成纤维细胞%PUFAs
人汎素啟動子UbB%Fat-1%錶達載體%綿羊成纖維細胞%PUFAs
인범소계동자UbB%Fat-1%표체재체%면양성섬유세포%PUFAs
旨在构建不饱和脂肪酸脱氢酶基因Fat-1表达载体,实现人泛素启动子UbB调控外源基因Fat-1在绵羊细胞内表达.PCR扩增得到UbB序列,秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性优化后,由公司合成获得oFat-1基因序列,以及pcDNA3.1中的GBHpolyA序列共同插入pCMV-DsRed2-1载体的多克隆位点(MCS),得到重组真核表达载体pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,载体序列经酶切测序鉴定.线性化的表达载体采用脂质体包裹后转染绵羊成纤维细胞,经G418抗性和红色荧光标记筛选得到阳性细胞,并对阳性细胞进行PCR和反转录PCR鉴定,HPLC检测细胞中不饱和脂肪酸的变化.构建的真核表达载体序列正确,Fat-1基因能够在绵羊成纤维细胞基因组中正常表达,促进细胞ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化,ω-3PUFAs占总量的百分比从11.48％增加到24.41％,ω-6PUFAs的百分比从88.52％下降到75.59％,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值从7.82±0.18下降到3.10±0.03,差异极显著(P＜0.01).成功构建了UbB启动子介导的Fat-1真核表达载体,筛选得到表达不饱和脂肪酸脱氢酶的绵羊细胞,为进一步制备转基因克隆绵羊奠定了基础.
旨在構建不飽和脂肪痠脫氫酶基因Fat-1錶達載體,實現人汎素啟動子UbB調控外源基因Fat-1在綿羊細胞內錶達.PCR擴增得到UbB序列,秀麗隱桿線蟲Fat-1基因密碼子根據綿羊對同義密碼子使用偏好性優化後,由公司閤成穫得oFat-1基因序列,以及pcDNA3.1中的GBHpolyA序列共同插入pCMV-DsRed2-1載體的多剋隆位點(MCS),得到重組真覈錶達載體pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,載體序列經酶切測序鑒定.線性化的錶達載體採用脂質體包裹後轉染綿羊成纖維細胞,經G418抗性和紅色熒光標記篩選得到暘性細胞,併對暘性細胞進行PCR和反轉錄PCR鑒定,HPLC檢測細胞中不飽和脂肪痠的變化.構建的真覈錶達載體序列正確,Fat-1基因能夠在綿羊成纖維細胞基因組中正常錶達,促進細胞ω-6PUFAs嚮ω-3PUFAs轉化,ω-3PUFAs佔總量的百分比從11.48％增加到24.41％,ω-6PUFAs的百分比從88.52％下降到75.59％,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值從7.82±0.18下降到3.10±0.03,差異極顯著(P＜0.01).成功構建瞭UbB啟動子介導的Fat-1真覈錶達載體,篩選得到錶達不飽和脂肪痠脫氫酶的綿羊細胞,為進一步製備轉基因剋隆綿羊奠定瞭基礎.
지재구건불포화지방산탈경매기인Fat-1표체재체,실현인범소계동자UbB조공외원기인Fat-1재면양세포내표체.PCR확증득도UbB서렬,수려은간선충Fat-1기인밀마자근거면양대동의밀마자사용편호성우화후,유공사합성획득oFat-1기인서렬,이급pcDNA3.1중적GBHpolyA서렬공동삽입pCMV-DsRed2-1재체적다극륭위점(MCS),득도중조진핵표체재체pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,재체서렬경매절측서감정.선성화적표체재체채용지질체포과후전염면양성섬유세포,경G418항성화홍색형광표기사선득도양성세포,병대양성세포진행PCR화반전록PCR감정,HPLC검측세포중불포화지방산적변화.구건적진핵표체재체서렬정학,Fat-1기인능구재면양성섬유세포기인조중정상표체,촉진세포ω-6PUFAs향ω-3PUFAs전화,ω-3PUFAs점총량적백분비종11.48％증가도24.41％,ω-6PUFAs적백분비종88.52％하강도75.59％,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs비치종7.82±0.18하강도3.10±0.03,차이겁현저(P＜0.01).성공구건료UbB계동자개도적Fat-1진핵표체재체,사선득도표체불포화지방산탈경매적면양세포,위진일보제비전기인극륭면양전정료기출.
