CAJ | 학술논문

目的构建携带人EZH2基因3’非翻译区(3'UTR)的慢病毒筛选载体并实现该重组体在人乳腺癌MCF-7中稳定整合,为下一步MicroRNAs(miRNAs)筛选奠定基础.方法从组织中提取并用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出EZH2基因3'UTR,构建携带EZH2基因3'UTR的重组慢病毒载体CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR,脂质体法将重组的慢病毒载体和包装载体混合物共转染工具细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒.用裂解液裂解病毒颗粒,根据慢病毒载体上的CMV启动子表达量检测病毒滴度.用慢病毒颗粒感染乳腺癌MCF-7细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定整合的乳腺癌细胞MCF-7,用Real-Time PCR和Western blotting方法检测EZH2基因3'UTR是否整合入细胞MCF-7中.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序结果证实,EZH2基因3'UTR成功定向克隆到慢病毒载体上.Real-Time PCR检测病毒滴度为4.3 × 109拷贝/mL.筛选稳定整合MCF-7细胞的最佳浓度为0.2μg/mL.重组慢病毒转导MCF-7后,Real-Time PCR和Western blotting方法分别检测EZH2基因3'UTR整合到乳腺癌细胞MCF-7基因组中.慢病毒感染实验组和对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论成功构建携带EZH2基因3'UTR慢病毒筛选载体,实现重组体在乳腺癌MCF-7细胞中稳定整合.
목적 구건휴대인EZH2기인3’비번역구(3'UTR)적만병독사선재체병실현해중조체재인유선암MCF-7중은정정합,위하일보MicroRNAs(miRNAs)사선전정기출.방법 종조직중제취병용실시형광정량취합매련반응(RT-PCR)확증출EZH2기인3'UTR,구건휴대EZH2기인3'UTR적중조만병독재체CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR,지질체법장중조적만병독재체화포장재체혼합물공전염공구세포293T세포,포장산생만병독과립.용렬해액렬해병독과립,근거만병독재체상적CMV계동자표체량검측병독적도.용만병독과립감염유선암MCF-7세포후,통과표령매소사선은정정합적유선암세포MCF-7,용Real-Time PCR화Western blotting방법검측EZH2기인3'UTR시부정합입세포MCF-7중.결과 PCR확증검측양성균락화측서결과증실,EZH2기인3'UTR성공정향극륭도만병독재체상.Real-Time PCR검측병독적도위4.3 × 109고패/mL.사선은정정합MCF-7세포적최가농도위0.2μg/mL.중조만병독전도MCF-7후,Real-Time PCR화Western blotting방법분별검측EZH2기인3'UTR정합도유선암세포MCF-7기인조중.만병독감염실험조화대조조비교,차이유통계학의의(P＜0.01).결론 성공구건휴대EZH2기인3'UTR만병독사선재체,실현중조체재유선암MCF-7세포중은정정합.