CAJ | 학술논문

液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动和执行细胞程序性死亡的关键基因,β型VPE是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因.本研究以黑比诺葡萄(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板,通过RT-PCR扩增得到葡萄β型液泡加工酶基因(暂命名VvβVPE,GenBank登录号:KC136352),开放阅读框1 485 bp.进一步将VvβVPE克隆到pGEX-6P-1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导,获得约81.3 kD的包涵体融合蛋白GST-VvβVPE.将诱导条件优化后,在37℃、0.05 mmol/L IPTG诱导5h后融合蛋白GST-VvβVPE的表达量最大,采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白,电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求.使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清,经Western blot检测,该抗血清(稀释到1∶10 000)与GST-VvβVPE融合蛋白识别反应良好,获得的抗血清可用于以后的VvβVPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等,为进一步明确VvβVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据.
액포가공매(VPE)기인시식물내계동화집행세포정서성사망적관건기인,β형VPE시충자특이표체병차위충자단백성숙소필수적기인.본연구이흑비낙포도(Vitis vinifera cv.Pinot Noir)화후8개불동시기배주적cDNA혼합양위모판,통과RT-PCR확증득도포도β형액포가공매기인(잠명명VvβVPE,GenBank등록호:KC136352),개방열독광1 485 bp.진일보장VvβVPE극륭도pGEX-6P-1원핵표체재체병전입대장간균(Escherichia coli)BL21중,경IPTG유도,획득약81.3 kD적포함체융합단백GST-VvβVPE.장유도조건우화후,재37℃、0.05 mmol/L IPTG유도5h후융합단백GST-VvβVPE적표체량최대,채용전투석여염산고처리후투석복성량충방법획득순화포함체단백,전투석순화법획득순화포함체단백적농도가체도면역요구.사용순화단백면역신서란대백토제비다극륭항혈청,경Western blot검측,해항혈청(희석도1∶10 000)여GST-VvβVPE융합단백식별반응량호,획득적항혈청가용우이후적VvβVPE적매활성분석、면역아세포정위분석이급전기인식주단백수평적감정등,위진일보명학VvβVPE재포도배주발육중적작용제공기출수거.