心肺血管病杂志
心肺血管病雜誌
심폐혈관병잡지
JOURNAL OF CARDIOVASCULAR AND PULMONARY DISEASES
2013年
4期
499-502
,共4页
李国平%隋靖喆%毕楠%满永%王抒%陈保生%黎健
李國平%隋靖喆%畢楠%滿永%王抒%陳保生%黎健
리국평%수정철%필남%만영%왕서%진보생%려건
载脂蛋白AV%原核表达%蛋白纯化
載脂蛋白AV%原覈錶達%蛋白純化
재지단백AV%원핵표체%단백순화
Apolipoprotein AV%Prokaryotic expression%Protein purification
目的:构建人载脂蛋白AV(apolipoprotein AV,apoAV)的原核载体并表达纯化该蛋白.方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,以反转录的cDNA第一链为模板,经聚合酶链式反应(PCR)扩增得到含有编码apoAV完整成熟肽段的PCR片段.PCR产物和原核表达载体pET30b经核酸内切酶双切后连接,连接产物经转化至大肠杆菌感受态细胞Top10,挑选克隆测序.重组质粒pET30b-apoAV转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并优化诱导表达条件,重组的apoAV经镍离子螯合树脂纯化获得.结果:经测序证实人apoAV目的基因成功克隆入pET30b原核表达载体中,经过IPTG诱导有约40KD的特异性蛋白表达,与预期大小一致.该蛋白在IPTG诱导下的最佳表达时间为5h,最佳浓度在31.3 μmol/L.纯化的apoAV纯度在95％以上,产率约为15 mg/L.结论:成功构建人apoAV的原核表达载体,实现了高效表达和纯化,为进一步研究其结构与功能奠定了基础.
目的:構建人載脂蛋白AV(apolipoprotein AV,apoAV)的原覈載體併錶達純化該蛋白.方法:從人肝癌細胞繫HepG2中提取總RNA,以反轉錄的cDNA第一鏈為模闆,經聚閤酶鏈式反應(PCR)擴增得到含有編碼apoAV完整成熟肽段的PCR片段.PCR產物和原覈錶達載體pET30b經覈痠內切酶雙切後連接,連接產物經轉化至大腸桿菌感受態細胞Top10,挑選剋隆測序.重組質粒pET30b-apoAV轉化大腸桿菌BL21(DE3),經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導錶達,併優化誘導錶達條件,重組的apoAV經鎳離子螯閤樹脂純化穫得.結果:經測序證實人apoAV目的基因成功剋隆入pET30b原覈錶達載體中,經過IPTG誘導有約40KD的特異性蛋白錶達,與預期大小一緻.該蛋白在IPTG誘導下的最佳錶達時間為5h,最佳濃度在31.3 μmol/L.純化的apoAV純度在95％以上,產率約為15 mg/L.結論:成功構建人apoAV的原覈錶達載體,實現瞭高效錶達和純化,為進一步研究其結構與功能奠定瞭基礎.
목적:구건인재지단백AV(apolipoprotein AV,apoAV)적원핵재체병표체순화해단백.방법:종인간암세포계HepG2중제취총RNA,이반전록적cDNA제일련위모판,경취합매련식반응(PCR)확증득도함유편마apoAV완정성숙태단적PCR편단.PCR산물화원핵표체재체pET30b경핵산내절매쌍절후련접,련접산물경전화지대장간균감수태세포Top10,도선극륭측서.중조질립pET30b-apoAV전화대장간균BL21(DE3),경이병기-β-D-류대반유당감(IPTG)유도표체,병우화유도표체조건,중조적apoAV경얼리자오합수지순화획득.결과:경측서증실인apoAV목적기인성공극륭입pET30b원핵표체재체중,경과IPTG유도유약40KD적특이성단백표체,여예기대소일치.해단백재IPTG유도하적최가표체시간위5h,최가농도재31.3 μmol/L.순화적apoAV순도재95％이상,산솔약위15 mg/L.결론:성공구건인apoAV적원핵표체재체,실현료고효표체화순화,위진일보연구기결구여공능전정료기출.
