中国家禽
中國傢禽
중국가금
CHINA POULTRY
2013年
6期
8-12
,共5页
郑蒙蒙%李伟%施青青%王丹%黄晓梅%李碧春
鄭矇矇%李偉%施青青%王丹%黃曉梅%李碧春
정몽몽%리위%시청청%왕단%황효매%리벽춘
鸡%Dazl%真核表达载体%绿色荧光蛋白%亚细胞定位
鷄%Dazl%真覈錶達載體%綠色熒光蛋白%亞細胞定位
계%Dazl%진핵표체재체%록색형광단백%아세포정위
为克隆鸡Dazl(Deleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能.提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL.采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48 h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况.结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870 bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99％,编码氨基酸完全一致.酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功.转染48 h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949 bp特异条带和59.7 ku的融合蛋白.荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核.
為剋隆鷄Dazl(Deleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通過構建eGFP標記的DAZL真覈錶達載體,實現該基因產物的亞細胞定位以探究其生物信息學功能.提取1日齡鷄睪汍總RNA,通過巢式PCR方法擴增齣Dazl基因的CDS,構建真覈錶達載體pEGFP-C1-DAZL.採用LipofectaminTMLTX介導重組錶達載體pEGFP-C1-DAZL轉染CEF細胞,48 h後于熒光倒置顯微鏡下觀察其錶達定位,同時利用RT-PCR和Western-blot進一步鑒定eGFP-Dazl和蛋白水平的錶達情況.結果錶明:剋隆齣Dazl基因的完整CDS,長度870 bp,共編碼289箇氨基痠,與公佈的鷄Dazl基因(GenBank登陸號:NM_204218)CDS區同源性達99％,編碼氨基痠完全一緻.酶切鑒定和序列分析均錶明真覈錶達載體pEGFP-C1-DAZL構建成功.轉染48 h後,RT-PCR和Western-blot分彆檢測到949 bp特異條帶和59.7 ku的融閤蛋白.熒光顯微鏡觀察顯示,融閤蛋白(eGFP-Dazl)主要分佈于細胞覈.
위극륭계Dazl(Deleted in azoospermia-like,Dazl)기인CDS서렬,통과구건eGFP표기적DAZL진핵표체재체,실현해기인산물적아세포정위이탐구기생물신식학공능.제취1일령계고환총RNA,통과소식PCR방법확증출Dazl기인적CDS,구건진핵표체재체pEGFP-C1-DAZL.채용LipofectaminTMLTX개도중조표체재체pEGFP-C1-DAZL전염CEF세포,48 h후우형광도치현미경하관찰기표체정위,동시이용RT-PCR화Western-blot진일보감정eGFP-Dazl화단백수평적표체정황.결과표명:극륭출Dazl기인적완정CDS,장도870 bp,공편마289개안기산,여공포적계Dazl기인(GenBank등륙호:NM_204218)CDS구동원성체99％,편마안기산완전일치.매절감정화서렬분석균표명진핵표체재체pEGFP-C1-DAZL구건성공.전염48 h후,RT-PCR화Western-blot분별검측도949 bp특이조대화59.7 ku적융합단백.형광현미경관찰현시,융합단백(eGFP-Dazl)주요분포우세포핵.
