广东药学院学报
廣東藥學院學報
엄동약학원학보
ACADEMIC JOURNAL OF GUANGDONG COLLEGE OF PHARMACY
2014年
3期
358-362
,共5页
马艳%金小宝%李小波%鲍冬梅%陈洁鸿
馬豔%金小寶%李小波%鮑鼕梅%陳潔鴻
마염%금소보%리소파%포동매%진길홍
可溶性GPC3%基因%克隆%酵母表达
可溶性GPC3%基因%剋隆%酵母錶達
가용성GPC3%기인%극륭%효모표체
soluble GPC3%gene%cloning%Pichia pastoris expression
目的 克隆可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(soluble glypican-3,sGPC3)基因,并分泌表达重组蛋白.方法 通过RT-PCR克隆sGPC3 cDNA,利用EcoR Ⅰ和XbaⅠ酶切位点,将sGPC3基因插入酵母表达载体pPICZαA中,构建真核表达质粒pPICZαA-sGPC3,以该表达质粒转染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平板上进行筛选,然后对PCR鉴定为阳性的酵母重组子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDS-PAGE和Western blot检测.结果 使用特异性引物进行RT-PCR,获得约1 600 bp左右与目的基因大小相符的条带,构建的真核表达质粒pPICZαA-sGPC3表达框正确无误,阳性酵母重组子x-33/pPICZαA-sGPC3诱导表达上清在60 000处有与预期大小相符的蛋白条带,且该蛋白条带与抗6×His单克隆抗体孵育后呈现特异性反应.结论 成功克隆了可溶性GPC3基因,并在毕赤酵母中获得分泌表达,为进一步研究sGPC3对肝细胞癌的作用及作用机制、开发一种生物治疗肝癌的新型药物奠定了基础.
目的 剋隆可溶性燐脂酰肌醇蛋白聚糖3(soluble glypican-3,sGPC3)基因,併分泌錶達重組蛋白.方法 通過RT-PCR剋隆sGPC3 cDNA,利用EcoR Ⅰ和XbaⅠ酶切位點,將sGPC3基因插入酵母錶達載體pPICZαA中,構建真覈錶達質粒pPICZαA-sGPC3,以該錶達質粒轉染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平闆上進行篩選,然後對PCR鑒定為暘性的酵母重組子進行甲醇誘導錶達,錶達上清經SDS-PAGE和Western blot檢測.結果 使用特異性引物進行RT-PCR,穫得約1 600 bp左右與目的基因大小相符的條帶,構建的真覈錶達質粒pPICZαA-sGPC3錶達框正確無誤,暘性酵母重組子x-33/pPICZαA-sGPC3誘導錶達上清在60 000處有與預期大小相符的蛋白條帶,且該蛋白條帶與抗6×His單剋隆抗體孵育後呈現特異性反應.結論 成功剋隆瞭可溶性GPC3基因,併在畢赤酵母中穫得分泌錶達,為進一步研究sGPC3對肝細胞癌的作用及作用機製、開髮一種生物治療肝癌的新型藥物奠定瞭基礎.
목적 극륭가용성린지선기순단백취당3(soluble glypican-3,sGPC3)기인,병분비표체중조단백.방법 통과RT-PCR극륭sGPC3 cDNA,이용EcoR Ⅰ화XbaⅠ매절위점,장sGPC3기인삽입효모표체재체pPICZαA중,구건진핵표체질립pPICZαA-sGPC3,이해표체질립전염효모균주X-33,재함유Zeozin적YPD평판상진행사선,연후대PCR감정위양성적효모중조자진행갑순유도표체,표체상청경SDS-PAGE화Western blot검측.결과 사용특이성인물진행RT-PCR,획득약1 600 bp좌우여목적기인대소상부적조대,구건적진핵표체질립pPICZαA-sGPC3표체광정학무오,양성효모중조자x-33/pPICZαA-sGPC3유도표체상청재60 000처유여예기대소상부적단백조대,차해단백조대여항6×His단극륭항체부육후정현특이성반응.결론 성공극륭료가용성GPC3기인,병재필적효모중획득분비표체,위진일보연구sGPC3대간세포암적작용급작용궤제、개발일충생물치료간암적신형약물전정료기출.
