海洋学报(中文版)
海洋學報(中文版)
해양학보(중문판)
ACTA OCEANOLOGICA SINICA
2014年
8期
101-110
,共10页
李丽华%邱健健%蔡艺钦%于鹏%刘静雯
李麗華%邱健健%蔡藝欽%于鵬%劉靜雯
리려화%구건건%채예흠%우붕%류정문
海洋球石藻病毒%丝氨酸蛋白酶%基因克隆%重组表达%活性分析
海洋毬石藻病毒%絲氨痠蛋白酶%基因剋隆%重組錶達%活性分析
해양구석조병독%사안산단백매%기인극륭%중조표체%활성분석
Emiliania huxleyi virus (EhV)%serine protease (Sp)%gene clone%recombinant expression%activity analysis
从海洋球石藻 Emiliania huxleyi 病毒 EhV99B1的基因组中克隆了丝氨酸蛋白酶(Sp)基因(GenBank 登录号:KC161207),对该基因的开放阅读框(ORF)进行系统的生物信息学分析,并在大肠杆菌中融合表达,通过亲和层析法获得了纯化的重组 Sp。结果表明:EhV99B1-Sp 基因的 ORF 为1110 bp,编码368个氨基酸,蛋白相对分子质量为39.5 kDa;该基因片段与 GenBank 中 EhV86-Sp 的同源性很高,核苷酸及其对应的氨基酸序列同源性分别为95%和97%,而与其他物种 Sp 序列的同源性仅为28%~32%,说明其可能是丝氨酸蛋白酶家族中的一个新成员;预测的二级结构特征显示EhV99B1-Sp 的蛋白结构域中具有典型的 LTAGHC (组氨酸活性位点区域)和 AICNGDSGGPLF(丝氨酸活性位点区域)两个丝氨酸蛋白酶催化活性位点的氨基酸基序,是一个两次跨膜蛋白;将该基因在大肠杆菌中进行低温诱导表达,得到分子量为60 kDa 的重组蛋白,经鲤鱼肌肉丝氨酸蛋白酶(MB-SP)抗体检测证实为 Sp,且重组蛋白在大肠杆菌细胞中具有明显的生物学活性。本研究结果为进一步探讨 EhV99B1-Sp 在病毒与宿主相互作用过程中的调节作用及其功能与应用奠定基础。
從海洋毬石藻 Emiliania huxleyi 病毒 EhV99B1的基因組中剋隆瞭絲氨痠蛋白酶(Sp)基因(GenBank 登錄號:KC161207),對該基因的開放閱讀框(ORF)進行繫統的生物信息學分析,併在大腸桿菌中融閤錶達,通過親和層析法穫得瞭純化的重組 Sp。結果錶明:EhV99B1-Sp 基因的 ORF 為1110 bp,編碼368箇氨基痠,蛋白相對分子質量為39.5 kDa;該基因片段與 GenBank 中 EhV86-Sp 的同源性很高,覈苷痠及其對應的氨基痠序列同源性分彆為95%和97%,而與其他物種 Sp 序列的同源性僅為28%~32%,說明其可能是絲氨痠蛋白酶傢族中的一箇新成員;預測的二級結構特徵顯示EhV99B1-Sp 的蛋白結構域中具有典型的 LTAGHC (組氨痠活性位點區域)和 AICNGDSGGPLF(絲氨痠活性位點區域)兩箇絲氨痠蛋白酶催化活性位點的氨基痠基序,是一箇兩次跨膜蛋白;將該基因在大腸桿菌中進行低溫誘導錶達,得到分子量為60 kDa 的重組蛋白,經鯉魚肌肉絲氨痠蛋白酶(MB-SP)抗體檢測證實為 Sp,且重組蛋白在大腸桿菌細胞中具有明顯的生物學活性。本研究結果為進一步探討 EhV99B1-Sp 在病毒與宿主相互作用過程中的調節作用及其功能與應用奠定基礎。
종해양구석조 Emiliania huxleyi 병독 EhV99B1적기인조중극륭료사안산단백매(Sp)기인(GenBank 등록호:KC161207),대해기인적개방열독광(ORF)진행계통적생물신식학분석,병재대장간균중융합표체,통과친화층석법획득료순화적중조 Sp。결과표명:EhV99B1-Sp 기인적 ORF 위1110 bp,편마368개안기산,단백상대분자질량위39.5 kDa;해기인편단여 GenBank 중 EhV86-Sp 적동원성흔고,핵감산급기대응적안기산서렬동원성분별위95%화97%,이여기타물충 Sp 서렬적동원성부위28%~32%,설명기가능시사안산단백매가족중적일개신성원;예측적이급결구특정현시EhV99B1-Sp 적단백결구역중구유전형적 LTAGHC (조안산활성위점구역)화 AICNGDSGGPLF(사안산활성위점구역)량개사안산단백매최화활성위점적안기산기서,시일개량차과막단백;장해기인재대장간균중진행저온유도표체,득도분자량위60 kDa 적중조단백,경리어기육사안산단백매(MB-SP)항체검측증실위 Sp,차중조단백재대장간균세포중구유명현적생물학활성。본연구결과위진일보탐토 EhV99B1-Sp 재병독여숙주상호작용과정중적조절작용급기공능여응용전정기출。
A serine protease (Sp)gene (GenBank accession number:KC161207)was cloned from the genome of marine microalgal Emiliania huxleyi virus (Coccolithovirus )EhV99B1 isolate.Bioinformatic analysis was pre-formed on its open reading frame and the recombinant protein was expressed in E.coli and purified by affinity chromatography.Results showed that the length of the ORF of EhV99B1-Sp was 1 110 bp,which encoded a pro-tein of 386 amino acids with a molecular mass of 39.5 kDa and pI of 6.255.EhV99B1-Sp shared a high sequence similarity with EhV86-Sp,between whom the similarities of nucleotide sequences and deduced amino acid sequences were 95% and 97%,respectively.However,the sequence similarity between EhV99B1-Sp and serine protease from other organisms was only 28% to 32%.Sequences analysis suggested that EhV99B1-Sp might be a new member of the serine protease family.Secondary structure prediction showed that EhV99B1-Sp protein contained two motifs of typical serine protease catalytic active sites LTAGHC (histidine active site)and AICNGDSGGPLF (serine active site),and two transmembrane domains.A 60 kDa recombinant protein of EhV99B1-Sp was expressed in E.coli and confirmed by myofibril-bound serine proteinase (MBSP)antibody.The recombinant protein had normal bio-logical function in E.coli.These data laid a foundation for further studies of EhV99B1-Sp on regulation of virus-host interaction and its application.