医学研究杂志
醫學研究雜誌
의학연구잡지
JOURNAL OF MEDICAL RESEARCH
2014年
7期
19-22
,共4页
NLK%串联亲和纯化%质谱分析
NLK%串聯親和純化%質譜分析
NLK%천련친화순화%질보분석
NLK%Tandem affinity purification%Mass spectrometry
目的 利用串联亲和纯化结合质谱分析分离和鉴定与蛋白激酶NLK结合的蛋白复合物组分.方法 将RFP、NLK和其突变体NLKK155M克隆至本室改造的带有Flag和Strep双标签的反转录病毒载体pMSCVpuro中,通过酶切鉴定并测序验证其构建的正确性.采用反转录病毒感染结合嘌呤霉素筛选的方法,获得稳定表达RFP、NLK、NLK突变体NLKK155M的HCT-116细胞株,Western blot法检测目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的表达.采用串联亲和纯化结合质谱分析,分离、鉴定与NLK结合的蛋白.结果 构建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M质粒经测序证明构建正确.携带上述基因的反转录病毒感染的HCT-116细胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常表达.经串联亲和纯化和质谱分析,发现多个可能与NLK结合的蛋白.结论 本研究采用串联亲和纯化结合质谱分析成功鉴定了若干可能与NLK及其突变体NLKK155M结合的蛋白质.
目的 利用串聯親和純化結閤質譜分析分離和鑒定與蛋白激酶NLK結閤的蛋白複閤物組分.方法 將RFP、NLK和其突變體NLKK155M剋隆至本室改造的帶有Flag和Strep雙標籤的反轉錄病毒載體pMSCVpuro中,通過酶切鑒定併測序驗證其構建的正確性.採用反轉錄病毒感染結閤嘌呤黴素篩選的方法,穫得穩定錶達RFP、NLK、NLK突變體NLKK155M的HCT-116細胞株,Western blot法檢測目的蛋白RFP、NLK和NLKK155M的錶達.採用串聯親和純化結閤質譜分析,分離、鑒定與NLK結閤的蛋白.結果 構建的pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP和pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK質粒經酶切鑒定、測序證明質粒構建正確,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M質粒經測序證明構建正確.攜帶上述基因的反轉錄病毒感染的HCT-116細胞,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK和Flag-Strep-NLKK155M均正常錶達.經串聯親和純化和質譜分析,髮現多箇可能與NLK結閤的蛋白.結論 本研究採用串聯親和純化結閤質譜分析成功鑒定瞭若榦可能與NLK及其突變體NLKK155M結閤的蛋白質.
목적 이용천련친화순화결합질보분석분리화감정여단백격매NLK결합적단백복합물조분.방법 장RFP、NLK화기돌변체NLKK155M극륭지본실개조적대유Flag화Strep쌍표첨적반전록병독재체pMSCVpuro중,통과매절감정병측서험증기구건적정학성.채용반전록병독감염결합표령매소사선적방법,획득은정표체RFP、NLK、NLK돌변체NLKK155M적HCT-116세포주,Western blot법검측목적단백RFP、NLK화NLKK155M적표체.채용천련친화순화결합질보분석,분리、감정여NLK결합적단백.결과 구건적pMSCVpuro/N-Flag-Strep-RFP화pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK질립경매절감정、측서증명질립구건정학,pMSCVpuro/N-Flag-Strep-NLK155M질립경측서증명구건정학.휴대상술기인적반전록병독감염적HCT-116세포,Flag-Strep-RFP、Flag-Strep-NLK화Flag-Strep-NLKK155M균정상표체.경천련친화순화화질보분석,발현다개가능여NLK결합적단백.결론 본연구채용천련친화순화결합질보분석성공감정료약간가능여NLK급기돌변체NLKK155M결합적단백질.
