皮肤性病诊疗学杂志
皮膚性病診療學雜誌
피부성병진료학잡지
DIAGNOSIS AND THERAPY JOURNAL OF DERMATO-VENEREOLOGY
2014年
4期
291-296
,共6页
张三泉%高歆婧%丘文苑%陈荃%周欣%田歆%唐志平%赵恬%张芳
張三泉%高歆婧%丘文苑%陳荃%週訢%田歆%唐誌平%趙恬%張芳
장삼천%고흠청%구문원%진전%주흔%전흠%당지평%조념%장방
pLVX-shRNA1系统%RNA干扰%TGM1基因%HaCaT细胞
pLVX-shRNA1繫統%RNA榦擾%TGM1基因%HaCaT細胞
pLVX-shRNA1계통%RNA간우%TGM1기인%HaCaT세포
目的:构建针对转谷氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1,TGM1)的shRNA表达载体,通过脂质体进行HaCaT细胞内转染,筛选出最显著抑制TGM1的shRNA干扰载体.方法:构建三个针对TGM1基因的RNA干扰质粒:pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi.通过双酶切、PCR鉴定及基因片段测序分析验证构建效果.脂质体介导质粒转染HaCaT细胞.实时定量RT-PCR检测TGM1 mRNA的表达,Western blot检测TGM1蛋白的表达.结果:重组构建的三个干扰载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,三对碱基成功插入到预计位点,序列完全一致.转染三个重组干扰表达载体72小时后,RT-PCR检测TGM1基因沉默的效率,pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi分别为62.4％、73.5％和91.3％;Western blot检测TGM1蛋白的表达水平均明显降低,其中pLVX-1649shRNAi干扰载体降低最明显.结论:成功构建了TGM1 shRNA重组慢病毒载体,并且筛选出最有效抑制TGM1表达的干扰载体pLVX-1649shRNA,为进一步研究TGM1基因在鱼鳞病发病中的功能奠定基础.
目的:構建針對轉穀氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1,TGM1)的shRNA錶達載體,通過脂質體進行HaCaT細胞內轉染,篩選齣最顯著抑製TGM1的shRNA榦擾載體.方法:構建三箇針對TGM1基因的RNA榦擾質粒:pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi.通過雙酶切、PCR鑒定及基因片段測序分析驗證構建效果.脂質體介導質粒轉染HaCaT細胞.實時定量RT-PCR檢測TGM1 mRNA的錶達,Western blot檢測TGM1蛋白的錶達.結果:重組構建的三箇榦擾載體經PCR分析及插入基因片段序列分析,三對堿基成功插入到預計位點,序列完全一緻.轉染三箇重組榦擾錶達載體72小時後,RT-PCR檢測TGM1基因沉默的效率,pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi和pLVX-1649shRNAi分彆為62.4％、73.5％和91.3％;Western blot檢測TGM1蛋白的錶達水平均明顯降低,其中pLVX-1649shRNAi榦擾載體降低最明顯.結論:成功構建瞭TGM1 shRNA重組慢病毒載體,併且篩選齣最有效抑製TGM1錶達的榦擾載體pLVX-1649shRNA,為進一步研究TGM1基因在魚鱗病髮病中的功能奠定基礎.
목적:구건침대전곡안선알매1기인(transglutaminase 1,TGM1)적shRNA표체재체,통과지질체진행HaCaT세포내전염,사선출최현저억제TGM1적shRNA간우재체.방법:구건삼개침대TGM1기인적RNA간우질립:pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi화pLVX-1649shRNAi.통과쌍매절、PCR감정급기인편단측서분석험증구건효과.지질체개도질립전염HaCaT세포.실시정량RT-PCR검측TGM1 mRNA적표체,Western blot검측TGM1단백적표체.결과:중조구건적삼개간우재체경PCR분석급삽입기인편단서렬분석,삼대감기성공삽입도예계위점,서렬완전일치.전염삼개중조간우표체재체72소시후,RT-PCR검측TGM1기인침묵적효솔,pLVX-543 shRNAi、pLVX-1265shRNAi화pLVX-1649shRNAi분별위62.4％、73.5％화91.3％;Western blot검측TGM1단백적표체수평균명현강저,기중pLVX-1649shRNAi간우재체강저최명현.결론:성공구건료TGM1 shRNA중조만병독재체,병차사선출최유효억제TGM1표체적간우재체pLVX-1649shRNA,위진일보연구TGM1기인재어린병발병중적공능전정기출.
