科学技术与工程
科學技術與工程
과학기술여공정
SCIENCE TECHNOLOGY AND ENGINEERING
2014年
28期
269-273
,共5页
赵轶君%刘莹%薛添%魏琪%季佳菲%陈富林%李红民
趙軼君%劉瑩%薛添%魏琪%季佳菲%陳富林%李紅民
조질군%류형%설첨%위기%계가비%진부림%리홍민
类人弹性蛋白%可溶性表达%原核细胞%生物材料
類人彈性蛋白%可溶性錶達%原覈細胞%生物材料
류인탄성단백%가용성표체%원핵세포%생물재료
human elastin-like polypeptide%soluble expression%prokaryotic cell%biomaterials
类人弹性蛋白是由VAPGVG六肽重复序列构成的多肽.研究通过全基因合成获得上游引入NcoⅠ和下游引入XhoⅠ限制性内切酶位点的[(VAPGVG)3S]4基因编码序列,通过定向递归连接技术在pMD19-T simple克隆载体中构建[(VAPGVG)3S]32基因编码序列.利用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切从重组克隆载体中回收[(VAPGVG)3s]32 (ELPs)基因编码序列,在T4DNA连接酶作用下与NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理的线性化载体DNA分子pET28a(+)重组,重组混合物转化大肠杆菌Top10感受态细胞.从添加有50 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆,碱法小量抽提质粒DNA,经酶切及序列测定筛选出序列正确的重组质粒DNA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.从添加有50 μg· mL-1卡那霉素的LB平板上随机挑取37℃培养过夜的转化克隆至新鲜配制的TB液体培养基中,于37℃、200 r· min-1培养至OD600约为0.60h,添加终浓度为100 μg· mL-1的IPTG诱导类人弹性蛋白表达3h,SDS-PAGE凝胶电泳及Western blotting分析表明,该研究成功构建了类人弹性蛋白原核表达载体,在IPTG诱导作用下以可溶性状态高效表达.灰度扫描分析显示,重组类人弹性蛋白经IPTG诱导表达3h后,可达宿主细胞可溶性蛋白的28.3％.该工作为以大肠杆菌为表达宿主,大量制备类人弹性蛋白用于生物医学材料奠定了良好的基础.
類人彈性蛋白是由VAPGVG六肽重複序列構成的多肽.研究通過全基因閤成穫得上遊引入NcoⅠ和下遊引入XhoⅠ限製性內切酶位點的[(VAPGVG)3S]4基因編碼序列,通過定嚮遞歸連接技術在pMD19-T simple剋隆載體中構建[(VAPGVG)3S]32基因編碼序列.利用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切從重組剋隆載體中迴收[(VAPGVG)3s]32 (ELPs)基因編碼序列,在T4DNA連接酶作用下與NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切處理的線性化載體DNA分子pET28a(+)重組,重組混閤物轉化大腸桿菌Top10感受態細胞.從添加有50 μg·mL-1卡那黴素的LB平闆上隨機挑取37℃培養過夜的轉化剋隆,堿法小量抽提質粒DNA,經酶切及序列測定篩選齣序列正確的重組質粒DNA轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞.從添加有50 μg· mL-1卡那黴素的LB平闆上隨機挑取37℃培養過夜的轉化剋隆至新鮮配製的TB液體培養基中,于37℃、200 r· min-1培養至OD600約為0.60h,添加終濃度為100 μg· mL-1的IPTG誘導類人彈性蛋白錶達3h,SDS-PAGE凝膠電泳及Western blotting分析錶明,該研究成功構建瞭類人彈性蛋白原覈錶達載體,在IPTG誘導作用下以可溶性狀態高效錶達.灰度掃描分析顯示,重組類人彈性蛋白經IPTG誘導錶達3h後,可達宿主細胞可溶性蛋白的28.3％.該工作為以大腸桿菌為錶達宿主,大量製備類人彈性蛋白用于生物醫學材料奠定瞭良好的基礎.
류인탄성단백시유VAPGVG륙태중복서렬구성적다태.연구통과전기인합성획득상유인입NcoⅠ화하유인입XhoⅠ한제성내절매위점적[(VAPGVG)3S]4기인편마서렬,통과정향체귀련접기술재pMD19-T simple극륭재체중구건[(VAPGVG)3S]32기인편마서렬.이용NcoⅠ화XhoⅠ쌍매절종중조극륭재체중회수[(VAPGVG)3s]32 (ELPs)기인편마서렬,재T4DNA련접매작용하여NcoⅠ화XhoⅠ쌍매절처리적선성화재체DNA분자pET28a(+)중조,중조혼합물전화대장간균Top10감수태세포.종첨가유50 μg·mL-1잡나매소적LB평판상수궤도취37℃배양과야적전화극륭,감법소량추제질립DNA,경매절급서렬측정사선출서렬정학적중조질립DNA전화대장간균BL21(DE3)감수태세포.종첨가유50 μg· mL-1잡나매소적LB평판상수궤도취37℃배양과야적전화극륭지신선배제적TB액체배양기중,우37℃、200 r· min-1배양지OD600약위0.60h,첨가종농도위100 μg· mL-1적IPTG유도류인탄성단백표체3h,SDS-PAGE응효전영급Western blotting분석표명,해연구성공구건료류인탄성단백원핵표체재체,재IPTG유도작용하이가용성상태고효표체.회도소묘분석현시,중조류인탄성단백경IPTG유도표체3h후,가체숙주세포가용성단백적28.3％.해공작위이대장간균위표체숙주,대량제비류인탄성단백용우생물의학재료전정료량호적기출.
