中国水产科学
中國水產科學
중국수산과학
Journal of Fishery Sciences of China
2014年
5期
920-928
,共9页
冯文荣%柳淑芳%庄志猛%马骞%苏永全%唐启升
馮文榮%柳淑芳%莊誌猛%馬鶱%囌永全%唐啟升
풍문영%류숙방%장지맹%마건%소영전%당계승
线粒体DNA含量%实时荧光定量PCR%半滑舌鳎%优化
線粒體DNA含量%實時熒光定量PCR%半滑舌鰨%優化
선립체DNA함량%실시형광정량PCR%반활설탑%우화
mitochondrial DNA content%real-time quantitative PCR%Cynoglossus semilaevis%optimization
本研究旨在应用实时荧光定量PCR技术,建立半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)线粒体DNA(mtDNA)含量测定方法并进行优化.通过质粒标准品的线性化处理、模板DNA的酶切和超声处理、mtDNA和核DNA(nDNA)基因引物的筛选实验,建立半滑舌鳎mtDNA含量测定方法.结果表明,质粒标准品的构象对荧光定量PCR标准曲线影响较大,线性化的质粒更适合用作标准品;酚-氯仿方法提取的模板DNA适用于mtDNA含量测定,无需进行预处理;用D-loop和ND1这2对引物所得的拷贝数较小且结果一致,适用于mtDNA拷贝数的测定;以不同核基因为参照所得的mtDNA含量可能存在差异,当以单拷贝核基因ENC1和MYH6为参照时,可以计算出单个细胞中mtDNA含量,若以多拷贝基因GAPDH为参照,mtDNA含量测定值则较小.采用本方法分别对半滑舌鳎肝、肾、脾和肌肉组织的mtDNA含量进行重复性检测实验,结果表明,相同组织的mtDNA含量显示出良好的重复性(P＞0.05),而不同组织中mtDNA含量具有差异性,可见该方法稳定可靠,能为海洋鱼类mtDNA含量检测提供借鉴.
本研究旨在應用實時熒光定量PCR技術,建立半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)線粒體DNA(mtDNA)含量測定方法併進行優化.通過質粒標準品的線性化處理、模闆DNA的酶切和超聲處理、mtDNA和覈DNA(nDNA)基因引物的篩選實驗,建立半滑舌鰨mtDNA含量測定方法.結果錶明,質粒標準品的構象對熒光定量PCR標準麯線影響較大,線性化的質粒更適閤用作標準品;酚-氯倣方法提取的模闆DNA適用于mtDNA含量測定,無需進行預處理;用D-loop和ND1這2對引物所得的拷貝數較小且結果一緻,適用于mtDNA拷貝數的測定;以不同覈基因為參照所得的mtDNA含量可能存在差異,噹以單拷貝覈基因ENC1和MYH6為參照時,可以計算齣單箇細胞中mtDNA含量,若以多拷貝基因GAPDH為參照,mtDNA含量測定值則較小.採用本方法分彆對半滑舌鰨肝、腎、脾和肌肉組織的mtDNA含量進行重複性檢測實驗,結果錶明,相同組織的mtDNA含量顯示齣良好的重複性(P＞0.05),而不同組織中mtDNA含量具有差異性,可見該方法穩定可靠,能為海洋魚類mtDNA含量檢測提供藉鑒.
본연구지재응용실시형광정량PCR기술,건립반활설탑(Cynoglossus semilaevis)선립체DNA(mtDNA)함량측정방법병진행우화.통과질립표준품적선성화처리、모판DNA적매절화초성처리、mtDNA화핵DNA(nDNA)기인인물적사선실험,건립반활설탑mtDNA함량측정방법.결과표명,질립표준품적구상대형광정량PCR표준곡선영향교대,선성화적질립경괄합용작표준품;분-록방방법제취적모판DNA괄용우mtDNA함량측정,무수진행예처리;용D-loop화ND1저2대인물소득적고패수교소차결과일치,괄용우mtDNA고패수적측정;이불동핵기인위삼조소득적mtDNA함량가능존재차이,당이단고패핵기인ENC1화MYH6위삼조시,가이계산출단개세포중mtDNA함량,약이다고패기인GAPDH위삼조,mtDNA함량측정치칙교소.채용본방법분별대반활설탑간、신、비화기육조직적mtDNA함량진행중복성검측실험,결과표명,상동조직적mtDNA함량현시출량호적중복성(P＞0.05),이불동조직중mtDNA함량구유차이성,가견해방법은정가고,능위해양어류mtDNA함량검측제공차감.
